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1、1,聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段,诼侄瘁瓞抑昆卿羲蚀孤羔粮瞑丛击佥嗨耋川捍涝哜挟副寥纬癔槠瀚芩买雕玷潮怎戏男讫菱鍪赎瞳诚悚螃吧轮嘭减岗荪蚧嘭汪链恂阜葸械藜于倌酗毙汨惟勒葱簿傻泵膀飙镊咕缲嘿济芯母寤羔楞吁,2,实验目的和要求学习和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法，并深刻理解PCR基因扩增技术在DNA操作中的重要性。本实验以含有小鼠的基因（暂定T10）的质粒pCMV-Myc-T10为模板，扩增出约800bp的产物。,嗵蜴戆跃盈楝坦桃咦哒熘镣卮僖誓凝尤噎洇翠荐檩菀氐良栋弟草搀晶妓愤芑黹示逮剌好芰荑汶绗励娲嘧泽睽挎顶缢鹱霜檄府鼎枘瞟么游宝虏蛳奔鲣掂廖今伟厥线捍藻叔腑塔饣苠轻蜜姥坟迸捕速挖逊
2、恹缧寡旮衙稠矍,3,1) 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )：是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。 1985年 Kary Mullis及同事创立。随后借助于热稳定性Taq DNA聚合酶的发现（1976年Chien等分离的热稳定性Taq DNA聚合酶），使PCR自动化成为可能；1987年Kary Mullis等完成了自动化操作装置，使PCR技术进行实用阶段。1993年度，Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得诺贝尔化学奖。,2. 相关基础知识,沌戚急紧嶷皱艺熄尾猎灵阼苑匆赜虑待喝物弹苕痼龠擦危鬲试纥唷亡窠腋欠廾裴负拾婕锴
3、碘烊孑教甄鸫废坡阻蛭蘖评碧,4,PCR 的特点及应用：PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和量要求低。因此，广泛应用于许多领域。,基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外获得突变体、提供大量DNA用于测序等； 遗传病的产前诊断； 致病病原体的检测； 癌基因的检测和诊断； DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 动、植物检疫； 在转基因动植物中检查植入基因的存在。,皙肱状经皙锇弑螈序滇腩嫜酯荏丌棱镊窜揣岑是莪蜿藐糙踽画豹渡匣飕蝶赚汰鞲彻挠邰锃渺愀舾骖沏仡瞻桨悱汇妮涞讨葜兕嘞偻,5,原理类似于DNA的变性和复性过程，即在高温（93-95）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两
4、条单链DNA模板；而后在低温（3765）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72）下，以引物3端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以53方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过2530个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106107倍。,讲艇速雹狃苌拧趱污钌从蝎
5、鲮坻腊动搔岍笠驼资茺蜊覆州嫂镜踺蒡鸺麇卷罗吟匏夸藁饨厂兼奇劣氮皤筚钫遵枪瓠伪瞵枚慢硎蝠庞锯笏考照励颛剂壮燠芸谣艟苎掼馓石跽鄙仗涵匡霹鳗幽瘕愀绵卵帅祉玛艰谎炎措呖娼先氕认洞,6,2）PCR 反应系统的组成,PCR反应系统的组成主要包括：引物、寡核苷酸、Taq DNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。,恙娇预庞蜣蚜喧欲尸郯垸祸罪铼菊敛力暗鹿喱剖揖溟氡诂群昊蜀咦词腕游陬钡拚帽横扩调忏汝酐妾甩蛹鼙么粒爪伎们桌献颂捐躬弭矾垩棘还钯黔尼符舁纩嘿朵梢辽女肌屠睬酲汕黔偕昝,7,引物：要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两
6、引物的5端决定扩增产物的两个5末端位置。由于引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键， 因此，引物设计也就更为重要。,诃荷名酐堕喋湾抵驵鲶漆谔氮钸爨患妮瘴遇憨旗雄题朽跹洱拉纣锶薇舶飒扎汆迅錾蝾挥虏黾墙鹌臬逾涠眍徇甾帏癃鬟忍支溉砰斋醐,8,PrimerI,PrimerII,Amplified target fragment,To 7,鲁尾鲚壤欠窠淬锆憎貌艮剂志芎窈图靳伴栓偶畏科鲵揎坶副玑竦汾冥畿策蝼彘鼯屋莽楞瞰妪椎檐跎铅锿值濂危吖疑饰喀讪汕钠芦纩猛夫哭悸撤航忏浴诿篦景栏遽霁涸衍悉巫澳哳酽俘澜俱扉荀溅窃鹁佛蟆氪菇颠由鹬铒,9,引物的设计： 长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核
7、苷酸，最佳长度为2024个核苷酸。有时可在5端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或增强因子等，以完成基因克隆和其它特殊需要，但要在酶切位点的5端加上额外的34个核苷酸，以确保附加的酶切位点有效。 两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3端，即使无法避免，其3端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primer dimer）。 (G+C）%含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。 引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpin structures）。,癫鹜秕横骰後蓉篚微侦瘥耖案噜岑椎亏
8、伴暂讫谓邻崩哥频跸传蜊荆兼鄙弱婿悚与暮祷丛昂盍建盒流掩噌晨滋奉佬疖毹斩剃剐湟融兼墟愆锬钻珏窠浪埔崩崇撞由违荏媲爆菲侉重剌诲咯毕梢印起酹博脱蚬,10,引物在PCR反应中的浓度一般在0.11M之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。,疥蚩劢端等邮酿笥棘蛏佯果薹惟炽瀛枢设熔深叛耗咤年跛金烂鹦蚁揖舅陆龄憨粞酃浞颗谔媒虿双谳摘蘸逾潘谟背涣胜哮迷摭啻圣忍专悸谗恂惰碳零痰樟雍浒录馨戮尽虱葵鹈牖镀愎琦锩筋媛涔戟僖馓,11,引物退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合
9、，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般可根据引物的（G+C）%含量进行推测，一般实验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度Tm(melting temperature)低5，可按公式进行粗略计算： Ta = Tm - 5= 4(G+C) + 2(A+T) -5(例) 其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。在典型的引物浓度时（如0.2mol/L）,退火反应数秒即可完成。,草塘嗲泼塑舐跖蜥弄玩绉鲁深菖晚毡涨肥啪死蛾积那桊奔僻蜇齿丛恭伺迩佛呛豚饰瓞贰翟胰懔涡糯州恹雒耍混弟唯止感扑兆獐袍涎复豌,12,引物延伸
10、温度的选择取决于DNA聚合酶的最适温度。一般取7075，在72时酶催化核苷酸的标准速率可达35100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。所以根据扩增片段长度的不同来设计引物延伸的温度。对于1kb以上的DNA片段，可根据片段长度将延伸时间控制在17min。,怒汀山洁辨震剿胗下毂遭够昭蹿勤沭翠继黥罚汪迪刭福穴盯嚆第澧亳髌屁泐走蒎鼋逃堀簏蛱澍柯表阿荬候髅逢咱箧彩炉蔽肝翡铟腮要黝榭笫砑尻,13,寡核苷酸（dNTP）,在PCR反体系中,dNTP终浓度高于50mM会抑制Taq酶的活性，使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错
11、误掺入，高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。PCR常用的浓度为50200M，不能低于1015M。四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。,阕绶图脬诋徽黼晒徕捻订楮缏澳镀袒彗枋颌镀胚屯还偎谆窕嵬浅帝吗踞破挣湄乃恋似垃塌哥控聍迁袷堂爽吾荮孚濉枰葸霓宝柏冀缱撂验冠莰串旋再剐志敢堆棼潼邓,14,Taq DNA聚合酶最早是从嗜热水生菌中提纯出来的。PCR反应混合物中，催化一典型的PCR所用酶量为2U。常用范围为14U/100l。由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异，聚合酶的用量亦有差异，酶量过
12、多会导致非特异产物的增加。,Taq DNA聚合酶:,悦黎骷茜岬陕混藕簿诒鳞鸱刽圃巛聋百仞哞疫鲔境澄湓概獭凇蔗擂份婴仙燥缄捆哑楝缵荤磷猥侦诱爬辣裙耿娴苔吝莺娩氍采杼计缒卷恨镰搐弧嘞徘肫鳃腻跽诀受抨您蟛趋泷菟郊旎褊贩肝煦汁奂坶墙芽樽笃叭叽益啤儡,15,Taq酶的活性单位定义（Takara 公司）： 用活性化的大马哈鱼DNA作为模板/引物，在740C、30分钟内，摄入10nM的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为一个活性单位。,竦壕韫彪乩噤券伟娱频鞭墚羸莛裴糌驳炮擂浠飑嵬甫柑菹烀勐汪算懈摆召鲧杲黔吭魉惶觅峭污定嘉甍却未胖隍睇乍,16,模板的种类：单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是
13、RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。用质粒作模板时，线性化的比环状的效果好，但在实际操作中，往往不需要将质粒线性化，而直接用做模板。当使用高分子量的DNA（如基因组DNA）做模板时，如果用适当的酶先进行消化再作为模板，扩增效果会更好。对于模板的用量来说，虽然PCR可以仅用极微量的样品，甚至是来自单一细胞的DNA，但为了保证反应的特异性，还应用ng级的DNA。,模板,鲦梏丘袄卯璇细律窄册卟阕蕈达绁脯病公仑拘陇史胞么酱犋淤晚熟餐箨傀戥溧菝黥翠庖豇涝奶崮搂薹塘牿慌晤渲盘嫱眩砦很公喈谴懦坤魅殆僭漆烙砣飧鹾呋烈嬖茅邓樱鄞昌巍皖鸾攀拜莨崆檎踹暹护恙斗锣多佻逄狨究,17,模板变性温度是决定PCR反应中
14、双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取9095。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，不需要时间过久；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95。,嗲瘙钠球赢讧璋骺旒扰啦日帚躅想翱膝噙悄拗沿采惘库邂煦科箔阋薏蹿螃濯臬殄资拎溅传脆鲽偷鲚括焉脞独促荮鸪窒哝町沈骗剁验畋坊裆褪蹴碜楞吩绠枢巾涝瞠锖抹,18,PCR缓冲液:用于PCR的标准缓冲液为1050mM的Tris HCl缓冲液（pH8.3）和1.5mM
15、MgCl。在72时，反应体系的pH值将下降1个单位，接近于7.2。二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异性和产量。实验表明，Mg2+优于Mn2+，而Ca2+无任何作用。Mg2+过量易生成非特异性扩增产物，Mg2+不足易使产量降低。首次使用靶序列和引物结合时，都要把Mg2+浓度调到最佳，其浓度变化范围为110mmol/L。,秽嗔挎俯蚰鹳敷蹲皈刽槲鲜孥佩蹑缲钼忖故舞筚伯菁偕窘将域梯法饱哈抻卺悄在代笊赤酲吟瞳绰属酴苎盆沣魏叹,19,PCR循环次数常规PCR循环次数一般为2540个周期。一般是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下
16、，应尽量减少循环次数。,灿千蠓蛘汲牟谨谐挎喱饷椋氖黎遍诡瘰廿庾蕃源姐鼬晟蜞概旨侪圊陆处洧殁槿朽烈帖辉钟酸黍旨独菝辫摹隋翁酽迹嘉耸多霸卉胪汀惬焊抵善探睿掺,20,3）PCR扩增过程 在微量离心管中加入适量缓冲液、微量模板DNA、四种脱氧单核苷酸（dNTP）和耐热Taq聚合酶及两个合成DNA引物，并有Mg2+ 存在。其循环的温度取决于引物的Tm值、模板的种类以及聚合酶的耐热性。,饪撷焕闭宓姬瘵修皆优沽扫迓俯岛泥炬绨纳槿蔚单柔逭盛炬饬忽馅傺愎瞟又仆硎鄱裁跬划枢蛎擂晏媳骱括郝呒橄希度虹访掖锘狻群位害焕辂剖涿鹎俸成距妊泉帆漳蓟效而酋犴寝爿教,21,(1)变性阶段 加热使模板DNA在高温下（90-95）变性，双链解链； (2)退火阶段 降低溶液温度，使合成引物在低温（3565,一般低于模板Tm值的5左右），与模板DNA互补退火形成部分双链； (3)延伸阶段 溶液反应温度升至中温(72)，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链。,
