胶体金

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1、 胶体金是一种常用的标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。 在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以 至生物芯片中都可能例用到。1971 年 Faulk 和 Taytor 将胶体金引人免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免 疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主要是免 疫层析法( immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA)，用于检测 HBsAg、HCG 和抗双链抗体等，具有简单、快速、准确和无污 染等优

2、点。 免疫胶体金技术的基本原理氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶 溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质 等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷， 与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各 种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能， 可以与葡萄球菌蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白 多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。免疫金标记技术(

3、Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的 特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大 量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中， 这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。胶体金的制备方法胶体金的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、 硼氢化钠等。下面介绍最常用的制备方法及注意事项。、玻璃容器的清洁：玻璃表面少量的污染会干扰胶体金颗粒的生成，一切玻璃容器 应绝对清洁，用前经过酸洗、硅化。硅化过程一般是将玻璃容器浸泡于二氯二甲硅

4、烷 的氯仿溶液中分钟，室温干燥后蒸馏水冲洗，再干燥备用。专用的清洁器皿以第一次生 成的胶体金稳定其表面，弃去后以双蒸馏水淋洗，可代替硅化处理。、试剂、水质和环境：氯金酸极易吸潮，对金属有强烈的腐蚀性，不能使用金属药 匙，避免接触天平称盘。其水溶液在可稳定数月不变。实验用水一般用双蒸馏水。 实验室中的尘粒要尽量减少，否则实验的结果将缺乏重复性。金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞，故不能用金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞，故不能用 pH 电极测定金溶液的电极测定金溶液的 pH 值值。为了使 溶液 pH 值不发生改变，应选用缓冲容量足够大的缓冲系统，一般采用柠檬酸磷酸盐 (pH35.8)、Tris-HCL

5、 (pH5.88.3)和硼酸氢氧化钠(pH8.510.3)等缓冲系统。但应注意不 应使缓冲液浓度过高而使金溶胶自凝。、柠檬酸三钠还原法制备金溶胶：取 0.01氯金酸水溶液 100ml 加热至沸，搅动下准确加入柠檬酸三钠水溶液 0.7ml，金黄色的氯金酸水溶液在 2 分钟内变为紫红色，继续煮沸 15 分钟，冷却后以蒸馏 水恢复到原体积，如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在 535nm，1cm/535=1.12。 金溶胶的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关，一旦颗粒大小发生变化，光散射也随之发 生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变化，这就是金溶胶用于免疫沉淀或称免疫凝集试验 的基础。金溶胶颗粒的直径

6、和制备时加入的柠檬酸三钠量是密切相关的，保持其他条件恒定，仅改变加入的柠檬酸三钠量，可制得不同颜色的金溶胶，也就是不同粒径的金溶胶，见附 表。 附表 100 ml 氯金酸中柠檬酸三钠的加入量对金溶胶粒径的影响1%柠檬酸三 钠 ml0.300.450.701.001.502.00金溶胶颜色蓝灰紫灰紫红红橙红橙吸收峰(nm)220240535525522518径粒(nm)14797.571.54124.515、柠檬酸三钠鞣酸混合还原剂：用此混合还原剂可以得到比较满意的金溶胶，操作方 法如下：取 4ml柠檬酸三钠 (Na3C6H5O7.2H2O)，加入 05ml鞣酸，05ml 25mmo/L K2C

7、O3（体积与鞣酸加入量相等） ，以双蒸馏水补至溶液最终体积为 20ml，加热 至 60取 1ml的 HAuCl4，加于 79ml 双蒸馏水中，水浴加热至 60，然后迅速将上 述柠檬酸鞣酸溶液加入，于此温度下保持一定时间，待溶液颜色变成深红色(约需 0.51 小时)后，将溶液加热至沸腾，保持沸腾 5 分钟即可。改变鞣酸的加入量，制得的胶 体颗粒大小不同。、白磷还原法：在 120ml 双蒸馏水中加入 1.5ml 1氯金酸和 1.4ml 0.1mol/L K2CO3，然后加入 1ml 五分之一饱和度的白磷乙醚溶液，混匀后室温放置 15 分钟，在回流 下煮沸 直至红褐色转变为红色。此法制得的胶体金直径

8、约 6nm，并有很好的均匀度，但 白磷和乙醚均易燃易爆，一般实验室不宜采用。要得到大小更均匀的胶体金颗粒，可采用甘油或蔗糖密度梯度离心，经分级后制得胶 体金颗粒直径的变异系数（）可小于。 免疫胶体金制备、蛋白质的处理：由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉， 故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否 则应先用微孔滤膜或超速离心除去。一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面而 减弱胶体金对蛋白质的吸附。、蛋白质最适用量的选择：将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取 0.1ml(含蛋白质 540ug)加到 1

9、ml 胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，分钟 后加入 0.1ml 10NaCl 溶液，混匀后静置小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体 金稳定的最适蛋白量再加 10即为最佳标记蛋白量。、标记：在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的，在此情况下 蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。下述标记步骤最为常见：用 0.1mol/L K2CO3或 0.1mol/L HCl 调节金溶胶至所需 pH(标记 SPA 时调到 pH6.0)。于 100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液（体积为 23ml） ，搅拌 23 分钟。加入 5ml 1%PEG20000 溶液。于 1000010

10、0000g 离心 3060 分钟（根据粒径大小选择不同离心条件） ，小心吸去 上清液（切忌倾倒） 。将沉淀悬浮于一定体积含 0.20.5mg/ml PEG20000 的缓冲液中，离心沉淀后，再用 同一缓冲液恢复，浓度以 1cm/540nm=1.5 左右为宜，以 0.5mg/ml 叠氮钠防腐，置 4保存。包被后的金溶胶也可浓缩后于 Sephadex G-200 柱进行凝胶层析分离纯化，以含 0.1的缓冲溶液洗脱。通常用 IgG 包被的金溶胶洗脱液 pH 为 8.2，以蛋白包被的 金溶胶洗脱液为 pH7.0。以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。胶体金的稳定性及

11、免疫胶体金的贮存胶体金具有很高的动力学稳定性，在稳定因素不受破坏时自身凝聚极慢，可放置数年 不发生凝聚。影响稳定的因素主要有电解质、溶胶浓度、温度、非电解质等。金溶胶必须有少量电解质作稳定剂，但浓度不宜过高。高浓度亲水性非电解质能剥去 胶粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物质促使溶胶凝聚，但一定量的高分子物质反 而可增加溶胶稳定性，如蛋白质、葡萄糖、PEG20000 等的加入有良好的稳定效果。当金溶胶吸附蛋白质后，溶胶的稳定性随溶液 pH 而变化，而这种变化又取决于吸附 蛋白质的等电点，如 ConA，过氧化物酶等，当 pH 较低时保持稳定，提高 pH 则显得不稳 定，接近等电点或略高时又变得

12、稳定了。标记后的胶体金溶液可用 0.20.5mg/ml PEG20000 作为稳定剂。在 410贮存数月有效，不宜冰冻。贮存中可能会发生程度不 同的凝聚，可离心除去。 免疫胶体金的应用、胶体金在电镜水平的应用胶体金应用电镜水平的研究最早，发展最快，应用最广泛。其最大优点是可以通过应 用不同大小的颗粒或结合酶标进行双重或多重标记。直径为 315nm 胶体金均可用作电镜 水平的标记物。315nm 的胶体金多用于单一抗原颗粒的检测，而直径 15nm 多用于检测 量较多的感染细胞。胶体金用于电镜水平的研究，主要包括：细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观 察。单层培养中细胞内抗原的检测。组织抗原的检测。

13、金标记在电镜水平的应用，主要方法包括：包埋前染色、包埋后染色、免疫负染色、 双标记技术和原位杂交技术等。实验证明，该法样本用量少、检测速度快、对比明显、操作简单、敏感性和特异性高， 既可用于抗原检测，也可用于抗体检测，因此，可同时适用于科研和诊断。、胶体金在光镜水平的应用胶体金同样可用做光镜水平的标记物，取代传统的荧光素、酶等。各种细胞涂片、切 片均可应用。主要用于：用单克窿抗体或抗血清检测细胞悬液或培养的单层细胞的膜表 面抗原。检测培养的单层细胞胞内抗原，组织中或亚薄切片中抗原的检测。胶体金用于光镜水平的研究，可以弥补其它标记物不可避免的本底过高和内部酶活性 干扰等缺点。、胶体金在流式细胞仪

14、中的应用：应用荧光素标记的抗体，通过流式细胞仪计数分析细胞表面抗原，是免疫学研究中的 重要技术之一。但由于不同荧光素的光谱相互重叠，区分不同的标记困难，因此必须寻找 一种非荧光素标记物，用于流式细胞计数。这样可以同时进行几种标记。该标记物必须能 够改变散射角，胶体金可以明显地改变红激光散射角，因而可以作为流式细胞仪的标记物 之一。、凝集试验：单分散的免疫金溶胶呈清澈透明的溶液，其颜色随溶胶颗粒大小而变 化，当与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚，溶胶颗粒极度增大，光散射随之发 生变化，颗粒也会沉降，溶液的颜色变淡甚至变成无色，这一原理可定性或定量地应用于免疫反应。、免疫印迹技术(immun

15、oblotting)：免疫印迹是一种较新的免疫化学技术。用聚丙烯 酰胺凝胶电泳将蛋白质分离，得到的区带转移至硝酸纤维素膜，然后用酶免疫法（或免疫 荧光、）进行定量。免疫胶体金也可用于该法的定量。转移后的硝酸纤维素膜与某特异性的抗体保温后， 再与经葡萄球菌蛋白致敏的胶体金温育，彻底洗去多余的胶体金，根据膜上胶体金颗粒 颜色深浅可测知样品中的特异性抗原。利用金颗粒可催化银离子还原成金属银这一原理，采用银显影剂增强金颗粒的可见性， 更可大大提高测定灵敏度，检测下限可低至 0.1ng，这种免疫金银染色法应用已日趋广泛。由于胶体金免疫印迹技术简便、快速，且有相当的高的灵敏度，在临床免疫诊断上有 很大的应

16、用潜力。、胶体金在肉眼水平的应用胶体金取代传统三大标记物，用于肉眼水平的免疫检测中。除了胶体金本身具有的特 点外，还有以下优点：试剂和样本用量极小，样本量可低至 12ul；不需 计数器、 荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器，更适于现场应用； 没有诸如放射性同位素、邻 苯二胺等有害物质参与；实验结果可以长期保存；时间大大缩短，提高了检测速度。 金标过程中，无共价键形成，是一定离子浓度下的物理吸附。因此几乎所有的大分子物质 都可被金标记，标记后大分子物质活性不发生改变。实验结果表明，胶体金的敏感性可达 到 ELISA 的水平。而结合银染色时，检测的敏感性更大大提高。胶体金在免疫层析快速诊断技术中的应用免疫层析法(immunochromatography)是近几年来国外兴起的一种快速诊断技术，其原 理是将特异的抗体先固定于硝 酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样 品（尿液或血