《生物化学_第九章_酶促反应动力学》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学_第九章_酶促反应动力学（59页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、2006-1-7,上海大学生命科学学院,第九章 酶促反应动力学,一、化学动力学基础,二、底物浓度对酶反应速率的影响,三、酶的抑制作用,四、温度对酶反应速度的影响,五、pH对酶反应的影响,六、激活剂对酶反应的影响,2006-1-7,上海大学生命科学学院,一、化学动力学基础,化学反应的两个基本问题：（1）反应进行的方向、可能性和限度；（2）反应进行的速率和反应机制。,（一）反应速率及其测定,反应速率是以单位时间内反应物或生成物浓度的改变来表示。用瞬时速率表示反应速率：v =dc/dt 反应速率的测定实际上就是测定不同时间的反应物或生成物的浓度。,2006-1-7,上海大学生命科学学院,（二）反应分
2、子数和反应级数,1. 反应分子数：在反应中真正相互作用的分子的数目。 单分子反应，双分子反应， 判断一个反应是单分子反应还是双分子反应，应先了解反应机制，即反应过程中各个单元反应是如何进行的。,2. 反应级数：根据实验结果，整个化学反应的速率服从哪种分子反应速率方程式，则这个反应即为几级反应。 一级反应，二级反应，零级反应。,2006-1-7,上海大学生命科学学院,（三）各级反应的特征,1. 一级反应 凡是反应速率只与反应物的浓度的一次方成正比的，这种反应就称为一级反应。 速率常数与半衰期成反比，半衰期与反应物的初浓度无关。 2. 二级反应 凡是反应速率与反应物浓度二次方（或两种物质浓度的乘积
3、）成正比的，这种反应就称为二级反应。 半衰期与初浓度成反比。 3. 零级反应 凡是反应速率与反应物浓度无关而受它种因素影响而改变的反应。 半衰期与初始浓度成正比。,2006-1-7,上海大学生命科学学院,二、底物浓度对酶反应速率的影响,（一）中间络合物学说,1903年，Henri用蔗糖酶水解蔗糖的实验,在低底物浓度时, 反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。 随着底物浓度的增加, 反应速度不再按正比升高，反应表现为混合级反应。 当底物浓度达到一定值，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。,2006-1-7,上海大学生命科学学院,酶与底物的
4、中间络合物学说（Henri和Wurtz）,S+E ES P+E,中间产物假说证据： （1）ES复合物已被电子显微镜和X射线晶体结构分析直接观察到。 （2）酶和底物的光谱特性在形成ES后发生变化。 （3）酶的物理性质经常在形成ES后发生变化。 （4）已分离得到ES复合物。 （5）平衡透析时，底物浓度在半透膜内外不等。,（二）酶促反应的动力学方程式,1.米氏方程式的推导,推导原则：从酶被底物饱和的现象出发，按照“稳态平衡”假说的设想进行推导。,米氏方程:,米氏常数:,米氏方程的推导,令：,将（4）代入（3），则：,ES生成速度：,，ES分解速度：,即：,则：,由于酶促反应速度由ES决定，即,将（2
5、）代入（1）得：,(3),当酶反应体系处于恒态时：,当Et=ES时，,酶反应速度与底物浓度的关系曲线,当S Km时,当SKm时,当S=Km时,本条件可准确测定酶活力,Km的物理意义,2006-1-7,上海大学生命科学学院,2.动力学参数的意义,（1）米氏常数的意义,a.不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数,只与酶的性质有关，而与其浓度无关。b.Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。c.Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。 （同一种酶有几
6、种底物就有几个Km值，其中Km值最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物）一般情况下，1/Km可以近似地表示酶对底物的亲和力大小， 1/Km愈大，表明亲和力愈大。,所以1/Km表示形成ES的趋势大小,特例： Km=K2/K1=Ks(在K3K1，K2时),d. Km与Ks Km不等于Ks。在K3K1、K2时， Km看作Ks，也只有此时1/Km 才可以近似表示酶与底物结合的难易程度。 e. Km与Km 无抑制剂时，ES的分解速度与形成速度的比值符合米氏方程，为Km; 而有抑制剂时发生变化，则不符合米氏方程，为Km 。,2006-1-7,上海大学生命科学学院,f.Km和米氏方程的实际应用若已知某个
7、酶的Km值，可以计算在某一个底物浓度时，反应速度相当于最大反应速度的百分率。 g.Km可以帮助推断某一反应的方向和途径,2006-1-7,上海大学生命科学学院,（2）Vmax和k3(kcat)的意义,在一定的酶浓度下，Vmax是一个常数，它只与底物的种类及反应条件有关。,当S很大时，Vmax=K3 E,K3代表酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，称为转换数（或催化常数，Kcat）， 表明酶的最大催化效率。,转换数的倒数即为催化周期：一个酶分子每催化一个底物分子所需的时间。 乳糖脱氢酶转换数为1000/秒，则它的催化周期为10-3秒,（3） Kcat/Km 的意义,在生理条件下， S
8、/Km=0.011.0,SKm 时：,Kcat/Km的上限是K1，即生成ES复合物的速度(酶促反应的速度不会超过ES的形成速度K1，在水相中不会超过108109）,衡量酶催化效率的参数：即其大小可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率,2006-1-7,上海大学生命科学学院,只有Kcat/Km可以客观地比较不同的酶或同一种酶催化不同底物的催化效率,2006-1-7,上海大学生命科学学院,3.利用作图法测定Km和Vmax值,（1） Lineweaver-Burk 双倒数作图法 米氏方程的双倒数形式：,基本原则：将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，再用作图法求出Km。,1 Km 1
9、 1 = . + v Vmax S Vmax,2006-1-7,上海大学生命科学学院,（2） Eadie-Hofstee 作图法,vv/S作图法,v,Vmax,-Km,2006-1-7,上海大学生命科学学院,（3） Hanes-Woolf 作图法,1 Km 1 1 = . + v Vmax S Vmax,在,两边均乘以S：,以 S作图,-Km,S,（4）Eisenthal 作图法,（5）Hill 作图法,（寡聚酶）,2006-1-7,上海大学生命科学学院,（三）多底物的酶促反应,1.多底物酶促反应按动力学机制分类,有序反应,只有Leading substrate (领先底物A)首先与酶结合，然
10、后B才能与酶结合，形成的三元复合物EAB（ternary complex)转变为EPQ，B 的产物P先释放，A的产物Q后释放。在缺少A时，B不能与E结合,E+A+BAEBPEQE+P+Q,（1）序列反应,2006-1-7,上海大学生命科学学院,A与其产物Q相互竞争地结合E，但A和B互不竟争 反应的总方向决定于A、Q的浓度和反应的平衡常数,NAD 与NADH相互竞争E上的NAD结合部位,随机反应,底物A、B与酶结合的顺序是随机的，形成的三元复合物AEB QEP，产物P、Q的释放顺序也是随机的。,限速步骤是AEB QEP A与Q相互竞争E上的底物结合部位A，B 与P相互竞争E上的底物结合部位B 反
11、应的总方向决定于A、B、Q、P的浓度和反应的平衡常数,（2）乒乓反应,底物A先与E结合成AE二元复合物，AE PF（修饰酶形式），释放第一个产物P，接着底物B与F形成FB，FB EQ，释放第二个产物Q。 A与Q 竞争自由酶形式E ，B与P竞争修饰酶形式F。 整个反应历程中只有二元复合物形式，没有三元复合物形式。,2.双底物反应的动力学方程,（1）乒乓机制的动力学方程,KmA： B达到饱和浓度时A的米氏常数 KmA： A的表观米氏常数 Vmax：AB都达到饱和浓度时的最大反应速度,2006-1-7,上海大学生命科学学院,乒乓机制的动力学曲线是两组平行直线 表观米氏常数KmA（KmB）随B（ A）
12、浓度的增大而增大 表观最大反应速度Vmax随B（A）的增大而增大,（2）序列机制的底物动力学方程,2006-1-7,上海大学生命科学学院,序列机制的动力学曲线是两组相交直线（交于X轴负侧） 交点在X轴：表观KmA（KmB）不随B（A）浓度变化而变化（ KmA= KmA 、 KmB= KmB） 交点在X轴上：表观KmA（KmB）随B（A）浓度的增加而减小 交点在X轴下：表观KmA（KmB）随B（A）浓度的增加而增大 表观最大反应速度Vmax随B（A）的增大而增大,2006-1-7,上海大学生命科学学院,三、酶的抑制作用,变性作用(denaturation)： 抑制作用(inhibiton)：使酶
13、活力下降或丧失但并不引起酶蛋白变性变性剂没有选择性 抑制剂有不同程度的选择性研究抑制剂对酶的作用有重大的意义： （1）药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开发 （2）了解生物体的代谢途径，进行人为调控或代谢控制发酵 （3）通过抑制剂试验研究酶活性中心的构象及其化学功能基团，不仅可以设计药物，而且也是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础,2006-1-7,上海大学生命科学学院,（一）抑制程度的两种表示方法,1、相对活力,相对活力分数(残余活力),相对活力百分数*100%,2、抑制率,抑制分数（被抑制活力）,抑制百分数,2006-1-7,上海大学生命科学学院,（二）抑制作用的类型,1、不可逆的抑制作用
14、抑制剂与酶活性中心（外）的必需基团共价结合，使酶的活性下降，无法用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。,2、可逆的抑制作用 抑制剂与酶蛋白非共价键结合，可以用透折、超滤等物理方法除去抑制剂而使 酶复活。,2006-1-7,上海大学生命科学学院,（1）竞争性抑制（Competitive inhibition）抑制剂具有与底物类似的结构，竞争酶的活性中心，并与酶形成可逆的EI复合物，阻止底物与酶结合。 可以通过增加底物浓度而解除此种抑制。,2006-1-7,上海大学生命科学学院,（2）非竞争性抑制（noncompetitive inhibition） 底物和抑制剂可以同时与酶结合，但是，中间
15、的三元复合物ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低。 抑制剂与酶活性中心以外的基团结合，其结构可能与底物无关。不能通过增加底物浓度的办法来消除非竞争性抑制作用。,2006-1-7,上海大学生命科学学院,（3）反竞争性抑制 酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合。 E+SES+I ESI P 常见于多底物的酶促反应中,2006-1-7,上海大学生命科学学院,（三）可逆抑制作用与不可逆抑制作用的鉴别,1、通过透析、超滤、凝胶过滤等 2、通过v-E速度曲线,E,v,1,2,3,(1) 反应体系中不加I。,(2) 反应体系中加入一定量的不可逆抑制剂。,(3)反应体系中加入一定量的可逆抑制剂。,2006-1-7,上海大学生命科学学院,I 增高,I 增高,3、通过可逆抑制剂的动力学曲线可以区分三种可逆抑制作用,（四）可逆抑制作用动力学,1、竞争性抑制,动力学方程：,（Ki为EI的解离常数）,Vmax不变; Km变大，而且随I浓度的增大而增大。,相对活力：,抑制分数：,抑制程度决定于I、S、Km和Ki,2、非竞争性抑制,动力学方程：,Km不变，Vmax降至Vmax/（1+I/Ki）,
