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1、基因治疗（gene therapy）,主要讲授内容： 一 概述 二 基因治疗分类 三 基因治疗的总体策略 四 基因治疗的基本程序 五 基因治疗应用（心血管疾病） 六 展望,一引言： 人类疾病，除单基因遗传病外，许多常见疾病如恶性肿瘤、高血压、糖尿病、冠心病等的发生，都是环境因子如化学物质、病毒或其它微生物、营养，以及体内的各种因素，包括精神因素、激素或中间产物等内外因素作用于人体基因的最后结果。,至于传染病，是由外源病原体如病毒、细菌及其它微生物引起的疾病，而这些病原体是通过它们的遗传物质及其表达产物作用于人体而致病。同时，这些病原体的遗传物质还可以在人体内不断复制。,所以，人的疾病的发生，都
2、是人细胞本身的基因改变或由外源病原体的基因及产物与人体相互作用的最后结果。为此，长期以来科学家们想象人类能否最终依靠遗传物质，无论是人本身的或外源的，来治疗疾病，包括纠正人自身基因的结构或功能上的错乱，阻止病变的进展，杀灭病变的细胞或抑制外源病原体遗传物质的复制，从而达到治疗的目的。,定义把基因转移到患者体内，使其发挥作用，以达到治疗疾病目的的技术称为基因治疗(Gene Therapy)。,基因治疗自Anderson于1990年进行了第一例应用腺苷脱氨酶基因（ADA），经反转录病毒导入人体自身T淋巴细胞，经扩增后输回患儿体内，获得了成功。患儿5年后体内10%造血细胞ADA基因呈阳性，除了还需应
3、用部分剂量的ADA蛋白外，其他体征正常。这一成功标记着基因治疗的时代已经开始。,二 基因治疗分类： 1.目的基因导入体内的方式体外途径(ex vivo)间接法， 回输法 体内途径(in vivo)直接法 2.靶细胞 体细胞：疾病相关细胞，免疫系统细胞，干细胞生殖细胞：严格禁止,间接法是指先将合适的靶细胞从体内取出，在体外扩增，并将外源基因导入细胞内使其高效表达，然后将这种基因修饰过的靶细胞回输病人体内，使外源基因在体内表达，从而达到治疗目的。,体内法是将外源基因直接或通过基因转移系统导入体内相关组织细胞，并在其中表达。导入体内之后必须进入靶细胞，有效表达并达到治疗目的。,三 基因治疗的总体策略
4、 基因治疗是通过在适当的靶细胞中有效表达重组目的基因片段而实现的。目前设计基因治疗策略的总体原则是：,1.直接补替缺陷的基因； 2.抑制非正常的基因产物表达； 3.以间接方式调节机体本身免疫系 统的抗病功能； 4.利用外源基因对病变细胞造成特 异性杀伤。,1.基因替代和基因矫正治疗 基因替代是指正常基因原位替代缺陷基因（或变异基因）。基因矫正是指将致病基因的异常碱基序列进行纠正，而正常序列部分予以保留。,2.代偿性基因治疗通过对有代偿功能的基因的正调控，开启其关闭状态来代偿功能异常的基因。例如，以某些作用剂提高珠蛋白基因的表达以治疗地中海贫血。,3.基因补偿性治疗基因补偿性治疗指将目的基因导入
5、病变细胞或其它细胞，不去除异常基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其表达产物补偿缺陷基因的功能或使原有的功能得以加强。目前基因治疗多采用此种策略。,4.基因失活性治疗基因失活性早期一般指反义核酸技术。它将特定的反义核酸，包括反义RNA、反义DNA和核酶导入细胞，在翻译和转录水平阻止某些基因的异常表达，以达到治疗疾病的目的。RNAi、肽核酸、基因敲除。,5.调控性基因治疗 通过导入编码调控蛋白的基因以治疗基因表达异常的疾病。如：以野生型P53基因治疗肺癌或急性白血病。,6.应用“自杀基因”的基因治疗 也称活化前体药物性基因治疗。某些病毒或细菌产生的酶能将对人体无毒或低毒的药物前体，在人体细胞内
6、一系列酶的催化下转变为细胞毒性物质，从而导致细胞死亡。,7.免疫修饰性基因治疗 免疫修饰性基因治疗即导入能使机体产生抗病毒或抗肿瘤免疫力的基因以达到治疗目的。例如：B7共刺激分子基因及各种淋巴细胞因子基因的导入和表达，直接注入抗原基因等。,8.化疗保护性基因治疗向正常细胞内导入单相或多相细胞毒性药物的抗性基因，使得正常细胞耐受化疗药物的能力大大提高。如：导入多药耐药基因（MDR），可使正常细胞获得广泛的化疗药物耐受性。,9.特异性细胞杀伤性基因治疗 利用DNA重组技术构建以特异性杀伤靶细胞为目标的导弹。具有导向性和杀伤性。,四.基因治疗的基本程序 （一）获得目的基因 要进行基因治疗，必须首先获
7、得目的基因并对其表达调控进行详细研究。目的基因来源有多种，主要包括：含目的基因的供体细胞的基因组DNA分离、预先分离克隆的基因、PCR扩增的基因及人工合成的基因。,（二）靶细胞的选择 已被应用的靶细胞有淋巴细胞、造血细胞、上皮细胞、角质细胞、成纤维细胞、肝细胞、肌细胞及肿瘤细胞。,1.发病器官及位置。 可以选择病变本身器官的细胞，也可以选择病变器官以外的细胞来作为基因治疗的靶细胞。例如：在肝脏病的基因治疗中，可以选择肝细胞作为基因治疗的靶细胞；在肿瘤基因治疗中，可选择肿瘤组织侵润的淋巴细胞或肿瘤细胞本身。,2.靶细胞应容易取出和移植 基因治疗常规途径：将靶细胞从体内取出，经基因转化后再移植回人
8、体内。这就要求靶细胞容易从体内取出和植回人体。最容易取出和移植的细胞当属血液系统的细胞。,3.靶细胞容易在体外培养 4.靶细胞容易实现基因转化 将目的基因转移到靶细胞的手段主要有物理、化学、融合及病毒载体四大类。,5.靶细胞应有较长的寿命 基因治疗、特别是某些单基因遗传缺陷性疾病的基因治疗，最终目标是要求外源基因长期、稳定的表达，直至终生。,（三）基因载体和基因转移系统目前使用的基因载体有病毒载体和非病毒载体。 1.非病毒介导的基因转移物理方法显微注射法 电穿孔法 直接注射法和微粒子轰击法,化学方法DNA-磷酸钙共沉淀法多聚阳离子-DNA复合物法脂质体-DNA复合物法融合法：通过原生质球相互融
9、合的方法，将目的基因导入靶细胞。,2.病毒介导的基因转移 该类方法是以病毒为载体，将目的基因导入靶细胞或器官，并使之表达。一般在基因转移中，所使用的病毒载体都是经过改建的有复制缺陷的病毒。,这些病毒缺失了其自身复制所必需的一些基因，然后将治疗基因、一些基因的调控成分（如启动子和增强子）以及polyA信号等插入，使之成为表达性载体。目前在基因转移中所使用的病毒载体有以下几种。,1.逆转录病毒（retrovirus,RV）RV是目前基因转移中应用最为广泛的一类病毒。是一类RNA病毒。由于缺失了自身包装所必需的蛋白（结构蛋白gap，多聚酶pol，包膜糖蛋白env）基因，因此其复制需依赖辅助细胞系。逆
10、转录病毒转染效率高，理论上可高达100%。,转染后，前病毒基因组（经反转录后形成的DNA）可与靶细胞基因组随机组合，因而能稳定的表达外源基因。 缺点：1）只能转染处于增殖状态的细胞；2）携带的外源基因不能太大（8-10Kb）；,3）逆转录病毒的感染依赖于靶细胞表面适宜受体存在，限制了它的应用，尤其是体内基因治疗的应用；4）理论上讲，从包装细胞释放出的复制缺陷的逆转录病毒只有一次性感染靶细胞，但在某种情况下也会造成野生型病毒的爆发。,5）由于病毒基因组是随机整合到靶细胞基因组的，因而具有致细胞癌变的可能；6）逆转录病毒不能耐受纯化和浓缩等处理过程，否则会使其感染活性大大下降。,逆转录病毒载体的构
11、建外源基因插入病毒基因组有两种方式，一种是直接将外源基因插入到病毒基因中；另一种是以外源基因取代病毒的必需结构基因。,在复制缺陷型病毒中，外源目的基因的插入使病毒基因灭火或以目的基因取代病毒的必需基因，使产生的重组前病毒不能表达病毒结构蛋白，因此转录产生的RNA不能被包装产生子代重组病毒，,必须借助辅助病毒的共感染或通过包装细胞提供病毒复制所必需的反式作用蛋白，然后才能包装产生子代重组病毒。这样获得的子代重组病毒仅仅具有一次感染性，避免了产生继发扩散感染的危险。,包装细胞（pakaging cell）包装细胞是通过基因工程技术对细胞进行修饰，使其产生病毒结构基因gag、pol、env所编码的蛋
12、白，为逆转录病毒载体包装成为重组病毒提供全面的病毒蛋白，同时，该包装细胞并不能转录产生编码完整病毒的基因组RNA，一句话，包装细胞本身不能产生任何形式的病毒颗粒。,逆转录病毒载体介导基因转移的一般过程： 1）目的基因克隆到逆转录病毒载体上；2）带有目的基因的逆转录病毒载体通过物理方法如磷酸钙介导或电穿孔法导入已选定的包装细胞；,3）根据载体所提供的筛选标记基因筛选转化细胞；4）选择具有高滴度重组病毒的转化细胞，分离重组病毒；5）重组病毒感染靶细胞，采用两种方式，一种是以无细胞带病毒上清和靶细胞一起温育；另一种以产病毒的包装细胞经射线照射致死后作为饲养细胞，被靶细胞在其上面培养达到目的。,6）如
13、采用体外感染，则将感染的细胞回输体内，分析治疗基因的表达及治疗效果；7）病毒感染的质量控制，在基因转移过程中要进行严格的质量控制。,基因转移的方法和途径逆转录病毒载体系统进行基因转移的方法主要有in vivo和ex vivo两种。基因治疗的早期多采用离体方案。离体方案基因转移效率高，具有明确的基因转移，但必须进行宿主细胞的体外分离培养，而大多数人体组织细胞，原代培养比较困难。,近年来，更多采用体内方案。重组逆转录病毒直接注射的途径主要有：1）采用静脉注射等途径，将重组病毒直接注射到机体内，通过重组病毒的感染作用实现基因转移；2）直接将产生重组逆转录病毒载体的包装细胞注射到组织或肿瘤中，由包装细
14、胞释放再感染靶细胞；,3）直接将表达载体，可以是非病毒性表达质粒，注射到人体内，如将HIV-1病毒载体注射到肌肉内，使其表达相应的env基因蛋白，引起相应的细胞免疫。,2.腺病毒（adenovirus,AV）AV是一些大的（约38kb）双链DNA。目前作为基因治疗中所用的AV载体通常是一些复制缺陷病毒，其基因缺失位于基因组的E1A-E1B或E3区。,AV既能感染增殖期细胞，也能感染静止期细胞。这类病毒比较稳定，且浓缩和纯化对其感染活性影响不大。其不足之处为：1）病毒基因组一般不与靶细胞基因组整合，因而其表达外源基因是暂时的和不稳定的；,2）在AV的生活周期中，有许多不同生物学活性的蛋白暂时表达
15、，其中也包括一些与细胞恶性转化相关的蛋白；3）感染细胞内大量病毒蛋白的表达，可导致机体对受染细胞的强烈免疫应答。这一毒副作用在体内基因治疗是必须引起足够的重视。,目前有报道利用Creloxp重组构建“无内脏（gutless）”AV载体可望解决AV的免疫原性问题；4）AV几乎可以感染所有细胞，缺乏特异性。或许可以通过使用组织特异性启动子来克服这一问题。,3.腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）:AAV属于微小病毒家族成员，是一类小的单链DNA病毒（基因组约4.7kb），非常稳定。本身无致病性，需辅助病毒（常为AV）存在时才能复制。AAV可感染人的细胞，并能整合至非分
16、裂相细胞。,大部分AAV基因组可去除，从而可使外源基因得以大量补足。AAV可以整合进入宿主细胞基因组，但不如RV的整合效率高。有趣的是，在感染细胞中，野生型AAV基因组可高效定点整合于人类第19号染色体长臂的特定位置上，这种整合可导致染色体基因重排，,而这种重排与慢性B淋巴细胞白血病相关。然而携带治疗性基因的AAV载体似乎不象它的野生型亲本，没有定点整合于19号染色体的相同特征。因此从安全的角度来考虑，这种AAV的定点整合有多大优越性，尚值得进一步探讨。,4.单纯疱疹病毒（herpes simplex virus,HSV）:HSV是一些双链DNA病毒（基因组约150kb），具有嗜神经细胞的特性，能在神经细胞内形成“终生隐性感染”。将外源基因导入并使之长久存在于中枢神经系统是该类病毒载体的一大特点。,如果能够选择性地调节目的基因的表达，而不诱导病毒基因的表达，这将对中枢神经系统疾病的基因治疗大有帮助。HSV的缺点：1）仅能感染分裂细胞，从而使之在成人脑组织中的应用受到限制。2）这类病毒（包括无复制能力的病毒）对靶细胞具有毒害作用，需慎重。,
