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1、用于组织工程的种子细胞,选择种子细胞的要求：,采用非侵袭手段或微创手段即可获得的组织； 分裂增殖能力强； 功能旺盛； 无或仅有极微弱的免疫排斥反应； 能连续传代，并且传代培养后不发生形态、功能及遗传物质的改变。 获得的种子细胞可以接种到受伤降解性支架，再移植到受伤组织。,第一节 同种自体、同种异体和异种细胞,自体的种子细胞 :,优点： 无免疫排斥，组织相容性好， 无伦理学障碍，临床应用好，这是较为理想的细胞来源。 缺点： 获得非常有限，尤其是当组织受伤较严重时，或机体条件不佳时，不能保证获得状态良好的细胞； 老年人自体细胞的增殖能力较差，形成新组织的能力相对较低； 取材时会造成机体的进一步破坏
2、，因而自体细胞在组织工程中不能得到广泛的应用。,同种异体的种子细胞：,优点 可由胚胎、新生儿和成年人体的组织中获得，来源广泛，获得容易，可预先库存备用。如果将同种异体细胞经过基因改造，建立无瘤倾向的标准细胞系，则能进行产业化生产。 胚胎来源的多种生物制品及细胞因其免疫原性很低，细胞的生命期长，分裂能力强。具有很好的治疗效果优于成体细胞。,缺点 需进一步研究其抗原性及进一步采取降低抗原性的措施，如应用免疫隔离技术等。,第一个组织工程产品人工皮肤,1997年3月经美国FDA批准上市 由新生儿的包皮成纤维细胞培植而成，种植在由聚乳酸和聚乙醇酸构成的支架上，呈层状结构，与正常人的皮肤极为相似，能分泌人
3、体皮肤胶原、生长因子和结构性蛋白。,移植数星期后，该支架材料逐渐降解，形成与正常皮肤结构相类似的组织，并与病人自身的皮肤很好地融合，不存在排异反应等，就连病人自身的血管和色素也会逐渐转移到“适移植”活性皮肤中去，愈后不留瘢痕。这种产品可以冻存并运输。,还有另外一种FDA认证的皮肤产品，它同时含有表皮和真皮。 该产品的制作是将成纤维细胞混入胶原凝胶中培养后，再在凝胶状混合物上滴加表皮细胞。 将该产品移植入患者后，在愈合过程中，部分由患者本身组织所替代，存在于真皮中的成纤维细胞可以分泌胞外基质蛋白，并可以对环境的改变作出反应。体外移植后，可以坚持长达6个月。,异种细胞作为种子细胞的可能性。,由于异
4、种移植存在超急排斥反应，即使克服了超急排斥反应，还需克服急性、慢性排斥反应。为了克服超急排斥反应，已成功地建立了转基因模型。一旦基本克服异种细胞的免疫反应及人畜共患疾病，异种细胞有可能作为组织工程的种子细胞。,第二节 干细胞的研究及其在组织工程中的应用,一、干细胞生物工程,干细胞生物工程是指在体外对于细胞进行操作，包括体外增殖、定向诱导、横向分化、基因修饰和组织成形等。 利用干细胞构建各种细胞、组织、器官作为移植器官的来源，已经成为干细胞医学生物工程应用的主要方向之一。,由于干细胞工程将改变传统的最为短缺的器官来源问题，科学家预言干细胞极有可能成为治疗目前难以治愈的疾病的新方法。 干细胞生物工
5、程是一个宏大的技术体系和项目群，在医药健康领域内是一种辐射力极大的替代性工程技术。,干细胞的基础和应用研究,干细胞的生物学特性和分类 干细胞与细胞替代治疗 干细胞与基因治疗 干细胞与组织工程,内容,干细胞(stem cell)研究的起源,1896年，E. B. Wilson首次用它描述了寄生虫生殖系里的祖细胞。 1961年，Till和McCulloch通过对脾集落形成的观察，发现造血干细胞具有多向分化的潜能和自我更新的能力。 1981年，英国剑桥大学的Evans和Kaufman用小鼠的内细胞群细胞首次建立了胚胎干细胞系。 1998年，美国威斯康星大学的Thomson和约翰霍普金斯医学院的Gea
6、rhart同时分别在美国两种权威的科学刊物“科学(Science)”和“美国科学院院报（PNAS)”上发表了人胚胎干细胞的研究报告。,干细胞的定义,简单的讲，干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞，能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。 从功能上讲，干细胞是一类具有多向分化潜能、自我更新能力的细胞， 是处于细胞系起源顶端的最原始的细胞，在体内能够分化产生某种特定组织类型的细胞。,干细胞的生物学特性,终身保持未分化或低分化特征，缺乏分化标记。 在机体的数目、位置相对恒定。 具有自我更新能力。 能够无限地分裂、增殖。可连续分裂几代，也可长期处于静止状态。 具有多向分化潜能，也具有
7、分化发育的可塑性，受所处微环境的影响。 分裂的慢周期性，大多数处于G0。 通过两种方式生长：对称分裂和不对称分裂。,干细胞的分类,具有与早期胚胎相似的形态特征 具有 自我更新和分化形成任何类型细胞的能力 有形成完整个体的分化潜能,胚胎干细胞 （embryonic stem cell, ESC; 全能干细胞） 特点：,胚胎干细胞主要来源 胚囊的内细胞团及受精卵发育至桑椹胚之前的早期胚胎细胞 从胎儿生殖嵴分离得到的原生殖细胞(EG)也具有ES细胞的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞 体细胞核转移至去核卵母细胞后也可以培育出类似胚胎干细胞的全能细胞,1、来源于胚胎内细胞群,2、来源于原始生殖细胞 （
8、primordial germ cell,PGC),PGC细胞的分离和培养 小鼠胎儿的获取 小鼠胎儿的处理 组织块消化 细胞培养,PGC细胞的获取,在成纤维细胞上 的生长,PGC细胞的生长行为,体外分化实验,讨论,选择分化抑制物，制备胚胎干细胞饲养层 胚胎干细胞的分离 胚胎干细胞的培养、克隆和传代以及培养条件的确定 胚胎干细胞鉴定方法的建立,小鼠体细胞核移植技术的初步研究,引言,体细胞核转移是治疗性克隆的关键技术,建立和掌握成熟的体细胞核移植技术，对在临床上成功地进行治疗性克隆的应用非常重要。,本研究以小鼠卵丘细胞为核供细胞，卵母细胞为核受体组成重构胚 , 分别进行了卵丘细胞的分离、分裂中期卵
9、母细胞的去核、供体细胞核的注射、重构胚的电融合以及卵母细胞的活化等研究，以建立和掌握成熟的体细胞核移植技术。,材料和方法,卵丘细胞的分离和卵母细胞的获取 去核与移核 卵母细胞的活化 电融合 体外培养,结果,从小鼠的输卵管中获取的卵丘细胞和卵母细胞,从另一小鼠的输卵管中获取的卵丘细胞和卵母细胞,将卵丘细胞核植入卵母细胞后，小鼠胚胎发育进入二细胞期,成体干细胞 (somatic stem cell, 多能干细胞和单能干细胞）,造血干细胞 骨髓间充质干细胞 神经干细胞 肝干细胞,肌肉卫星细胞 皮肤表皮干细胞 肠上皮干细胞 视网膜干细胞,成体干细胞在研究和应用方面的优点,可自体移植，避免了免疫排斥 不
10、具有无限的自我更新能力，导致细胞“永生化”甚至癌变的可能性很小 分化潜能有限，更容易诱导向特定的组织细胞分裂，也可以用于体内组织的原位修复 某种类型的成体干细胞有相同种组织的损伤部位迁移的趋势，可作为细胞治疗的定位 分离和使用成体干细胞不存在伦理问题,二、干细胞生物工程研究的主要内容,1胚胎干细胞的建系与定向诱导分化 分离人类胚胎干细胞； 建立及完善其体外增殖与定向诱导分化的技术； 建立胚胎干细胞株； 研究转基因或移核胚胎干细胞的增殖与分化及其调控机制； 诱导分化细胞的性能分析和鉴定，以及用于组织工程的可行性； 其他应用相关研究，如胚胎干细胞的免疫学特点研究。,2造血干细胞工程与造血和免疫重建
11、,不同来源(骨髓、动员外周血、脐带血)造血干细胞的分离纯化； 体外扩增与定向诱导分化； 造血干祖细胞增殖分化的分子调控机制； 造血干细胞的移植与免疫排斥； 以及相关的细胞治疗与基因治疗等。,3间充质干细胞与组织损伤修复,分离纯化人体骨髓等组织的间充质干细胞； 体外扩增并定向诱导其分化为骨、软骨、肌肉、肌腱、脂肪、真皮、基质等细胞； 对诱导分化细胞的性能进行分析和鉴定； 利用现代生物材料对部分组织进行三维重构； 并建立其冷冻保存、复苏、建系等相关技术与方法。,4神经干细胞工程与神经损伤修复,利用神经干细胞及体外培养技术结合神经再生支架，探索神经再生的新途径，为神经损伤修复的治疗提供新的更加有效的
12、途径。,5干细胞库,干细胞库是深低温储存干细胞的实验室或登记捐赠者相关资料的机构。 分为实物库和资料库。脐血干细胞库就是实物库，它是将新生儿的脐血采集冻存起来，供患者使用。每份脐血中只含几百万个干细胞，仅够幼儿和少年患者使用。对于成年患者，待干细胞扩增技术取得进展后即可解决。骨髓干细胞库可以建为资料库，它只对健康供者进行HIJA配型和资料登记，待需要时再采集骨髓。 干细胞库又分为公共库和自体库。,几种研究比较多的干细胞,胚胎干细胞能在体外进行培养传代，保持未分化二倍体状态以及全能性，具有形成嵌合体动物(chimeric animal)的能力，故广泛用于胚胎发育及胚胎工程方面的研究。 如果将胚胎
13、干细胞植入不能发育成个体的四倍体胚胎中，再将该胚胎植入小鼠子宫中，那么可以获得完全是由培养的胚胎干细胞产生的正常个体小鼠。这表明了胚胎干细胞又具有难以置信的全能性。,1、胚胎干细胞,2骨髓间充质干细胞,骨髓细胞有着干细胞的共同特性，可通过体外贴壁培养，或根据细胞表面的特异表达的分子来获得相对较纯的间充质干细胞群，对其进行体外定向诱导，研究它的发育机制或用于临床。 骨髓间充质干细胞取材方便且对机体无害，简单的骨髓穿刺即可获得，理论上可以分化为所有的间充质组织类型：骨、软骨、肌肉、肌腱、真皮等。骨髓间充质干细胞由于以上特性而成为基因治疗的良好载体。,3神经干细胞,神经干细胞存在于胚胎和成体脑组织的
14、特定部位，即所谓的神经干细胞岛(islands of NSCs)中，NSCs能够分化出神经元、神经胶质等多种类型的神经细胞。研究表明，这种神经生成机制可以终生维持。,当大脑受伤，某些神经元受损后，NSCs会受诱导而迁移到受损部位，并形成新的神经元来代替受损的神经元以修复大脑，生长为神经细胞。这些新发现，改变了传统的神经元不能再生的看法，为一些神经损伤性疾病带来了希望，,4成肌干细胞,成肌干细胞被看作可以发育为成熟骨骼肌的干细胞。成熟个体骨骼肌中的肌卫星细胞，体外可分化并融合成肌细胞，目前认为是成肌干细胞。 成肌干细胞起源于胚胎发育期神经管两侧的轴旁间充质细胞。 成肌细胞与型胶原凝胶复合, 如果
15、施加周期性应力，管形结构的胶原与成肌细胞能沿管的轴线排列。,四、干细胞在组织工程中的应用,目前的种子细胞在体外培养增殖一段时间后，出现群体生长停滞，虽然通过介入某些病毒基因(如SV40)可使细胞转化并继续增殖，但一段时间后细胞死亡率倍增并伴有染色体的异常。因此干细胞以其高增殖、多向分化能力作为一种新型的种子细胞正备受组织工程的关注。,研究较多的是骨髓基质干细胞或称为骨髓间充质干细胞,骨髓间充质干细胞的研究,（一）骨髓间充质干细胞的研究进展 “成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞” “骨髓基质细胞” “间充质干细胞”、“间充质祖细胞”或“骨源性干细胞”,骨髓间充质干细胞是指骨髓基质中含
16、有能分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或肌细胞的前体细胞群。 这类细胞群具有较强的增殖能力和多分化潜能，并且易于从骨髓中分离及体外扩增纯化，因此，近年来在组织工程领域备受重视 .,20世纪70年代中期，Friedenstein等首次报道，骨髓标本在培养过程发现有贴壁生长的细胞。具有粘附特性 ,细胞是多能的。 骨髓间充质干细胞仅占骨髓细胞的0.01万 1万，并随年龄的增加而减少。,培养的骨髓间充质干细胞具备干细胞的两个重要特征：强的自我增殖能力和分化多潜能性。 分化具有可塑性。BMSC的分化多潜能性具有重要的生理意义。,1骨髓间充质干细胞的分离和纯化研究,(1)BMSC密度梯度离心法 一次密度梯
17、度离心法 高分子聚蔗糖(商品名Ficoll)和 三碘化合物泛影葡胺组成的淋巴细胞分层液，密度为10770001，能有效地将人的红细胞、粒细胞和单个核细胞分开，成为获得富有淋巴细胞悬液的常规试剂。小鼠淋巴细胞的密度较大，常选用密度为1090的分层液。,连续密度梯度分离法 一般用低密度介质不断稀释高密度介质，即可获得自下而上由高密度到低密度的连续梯度。把密度不同的细胞放在液面上，经高速离心后，就可获得等密度的沉淀环，密度不同的细胞停留在与它们相等的密度层界面。人工合成的聚乙烯吡咯酮包裹的硅胶(商品名Percoll)试剂，可制备连续密度梯度。 可获得4层细胞组分。 从上而下依次为：死细胞组分、富含单个核细胞组分、小淋巴细胞组分、红细胞和粒细胞组分。,
