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1、第八章 环境毒理学常用研究方法,毒理学研究方法,第一节 实验准备,1.1 动物的准备 选择实验动物 编号与标记 固定与麻醉,（1）选择实验动物,黏膜刺激,高血压,1）种属的选择原则 在机体反应上与人体近似 易获得、易饲养、易管理 敏感、合适实验资料,大鼠致癌,豚鼠过敏反应,常用动物介绍,猫 气体、蒸气对黏膜的刺激 豚鼠或兔 皮肤 豚鼠 过敏性反应 猫、狗、兔 呕吐 兔和猫 体温 狗、兔、大鼠 血压 大鼠和小鼠 致癌 小鼠 慢性中毒对脏器的损害,2）个体选择 年龄：幼年成年，急性实验成年 性别：无特殊要求就雌雄各半 生理状态：如怀孕、哺乳 健康状态：检查、预检,（2）实验动物的标记编号,染色、烙
2、印、号牌,大动物：记录外表和毛色,（3）实验动物的捕捉及固定,做好防护 戴厚手套 用器具固定,（4）实验动物的随机分组,分2组：,任意从随机数字表的某一行某一数字开始抄录14个数,再抄录一个数字为78，因为归入A组的小鼠有8只，故以8除，得余数6。于是把第6个A（即编写为第12号的小鼠）划给B组,分3组：,再取一个随机数除以6，看余数,（5）实验动物的麻醉,动外科手术 避免剧烈挣扎 麻醉药物：乙醚,（1）全身麻醉 a）吸入法：开放法、封闭法挥发性 b）腹腔和静脉给药麻醉法非挥发性 （2）局部麻醉 a）猫：一般应用0.5-1.0%盐酸普鲁卡因 注射。粘膜表面麻醉宜用2%盐酸可卡因 b）兔在眼球手
3、术时，可于结膜囊滴入0.02%盐酸 可卡因溶液，数秒钟即可出现麻醉 c）狗：用0.5-1%盐酸普鲁卡因注射。眼鼻、咽喉 表面麻醉可用2%盐酸可卡因,麻醉注意事项,（1）静脉注射必须缓慢，同时观察肌肉紧张性、角膜反射和对皮肤夹捏的反应。当这些活动明显减弱或消失时，立即停止注射。配制的药液浓度要适中。 （2）麻醉时需注意保温。麻醉期间，动物的体温调节机能往往受到抑制，出现体温下降。保温的方法有：实验桌内装灯，电褥，台灯照射等。无论用哪种方法加温都应根据动物的肛门体温而定。 （3）慢性实验时，在寒冷冬季，麻醉剂在注射前应加热至动物体温水平。,1.2 毒物的准备,（1）了解毒物的物理常数 密度、溶解度
4、、蒸汽压、熔点、沸点、油/水分配系数等 （2）剂型： 毒性高、刺激性大稀释 固态溶液、软膏,（3）溶剂： 本身毒性很小或无毒 不与受检毒物产生增毒或 减毒作用 不影响毒物吸收 无特殊的刺激性或气味,1.3 生物材料的采集和制备,（1）血液的采集 需求少 刺破组织取毛细血管的血 需求多 静脉采血、动脉 注意：光线、温度、器皿消毒、 抗凝剂,割（剪）尾取血 眼眶静脉丛采血 断头取血 颈动脉取血 腹主动脉 股动（静）脉取血,（2）尿液的收集,连续收集 在代谢笼下配置粪尿分离漏斗 一次性尿液收集 逼尿法、导尿法、输尿管插管法 剖腹采集尿液、提鼠采集尿液,尿液收集注意事项,实验期间膳食一致，特定时间完成
5、收集 防止尿液的污染 标本迅速测定或冷冻保存 避免器皿污染 灌喂水或青菜满足尿量需求,（3）粪便的收集,代谢笼、粪尿分离器 外观形态新鲜、完整，分析时取内层粪便 器皿干净,（4）呼出气的收集,研究毒物的吸收代谢和对肺功能的影响 动物需固定,（5） 组织匀浆的制备,酶：取样洗净研磨离心 测定 用于毒物的测定,1.4 预备试验,（1）选择合适的实验动物 （2）设计染毒剂量及其分组 （3）操作技术的检验和训练 （4）发现新线索、新指标,第二节 常用染毒技术,2.常用染毒途径 吸入染毒、经皮肤染毒最重要的 灌胃 气管注入 注射（腹腔、静脉、肌内、皮下）,根据实验目的进行选择，同时考虑： （1）人群接触
6、环境毒物的实际情况 生产车间呼吸道 （2）毒物的理化性质 固态、液态、气态 （3）受检毒物的来源 消耗量的大小,2.1 吸入染毒法大气污染物,1） 动式吸入染毒法,优点： 柜内毒物浓度相对稳定 受试环境具有持久的稳定性 缺点： 毒物消耗量大,2）静式吸入染毒法急性,在具有一定气体容积的密闭容器中或在密封染毒柜内进行,优点：设备简单，操作方便 缺点：要经过一段时间才能达到实验浓度要求,3）面罩染毒法,优点：避免皮肤吸收 注意检查面罩的密封性,4）吸入染尘法,颗粒污染物 5m,2.2 气管注入法,经喉插入法 气管穿刺法 暴露气管穿刺法,适用于颗粒物染毒。 颗粒物可制备成生理盐水混悬液，也可将颗粒物
7、中的有害成分提取，再用提取物进行染毒。 此法需在动物麻醉下进行，难度较大，适宜急性试验,2.3 经口染毒法,不挥发性液体和固体毒物 灌胃法液体或制剂 喂饲法混在食物中 经口滴入淀粉糊剂 吞咽胶囊,2.4 注射染毒法,毒物对局部损害不能太大 腹腔注射 肌内注射 不溶于水但溶于油或其他溶剂 静脉注射 皮下注射 皮内注射,2.5 经皮染毒法,家兔和豚鼠 斑贴法 兔耳法 结膜囊染毒,第三节 毒理学实验的设计方法,3.1 实验设计 明确实验目的、了解毒物、预备实验 实验类型（急性、慢性）、实验动物 染毒方式、浓度分组、对照组（平行、自身） 3.2 动物分组 随机化,第四节 急性毒性实验,4.1 急性毒性
8、实验的内容 急性毒性测定LD50 / LC50 皮肤染毒实验经皮肤进入 局部作用实验有无刺激腐蚀 中毒症状的观察作用程度、部位 功能及病理组织学检查部位、程度,4.2 哺乳动物的急性毒性实验,一、半致死剂量的测定（途径？） （1）动物准备(小动物、预观察) （2）剂量选择 （3）药液配置及染毒等容量法 （4）症状观察 （5）病理学检查及其他指标观察 （6）结果评价LD50、毒性级别,剂量的选择,预实验测定：最大无作用剂量、100死亡剂量 按等比级数（2.2,一般1.21.5）间距设计浓度系列，系列浓度中有一个的死亡率为4060为最佳,二、急性阈剂量的测定,关键：选定适当的观测指标 机理肝肾、有
9、机磷农药胆碱酯酶 新化学物质整体状态、非特异性指标 实验方法 游泳试验、刺激阈试验,三、局部作用试验,皮肤和黏膜症状（豚鼠、家兔） 急性皮肤刺激/腐蚀试验 急性眼刺激/腐蚀试验 结膜囊染毒,四、急性联合毒性的测定,过筛试验 确定大概的作用类型 1/2LD50 死亡率80%，增毒；3080， 相加；30，拮抗 实测死亡率（O）/预期死亡率（P）,混合毒物LD50的测定方法 分别测定各毒物的LD50 按等毒性比例混合测定混合毒物的LD50 评定作用类型,K2.5 协同,4.3 水生动物毒性实验,一、鱼类毒性实验 动物选择区域代表性 实验条件水温、溶氧、pH 二、甲壳动物实验 水蚤幼虫的准备 TLm
10、的测定,斑马鱼,青鳉鱼,第五节 毒物蓄积的研究方法,蓄积毒性作用： 物质蓄积：环境污染物 进入排出 功能蓄积：结构和功能变化的积累,慢性、亚慢性实验必须先评价蓄积性,5.1 物质蓄积的研究方法,生物蓄积的极限值与其在单位时间内的吸收量成正比 生物半衰期越短，达到极限所需时间就短 A = aT1/21.44,5.2 功能蓄积的研究方法,固定剂量连续染毒法；5LD50，蓄 积作用不明显 剂量定期递增染毒法（等比递增） 20天蓄积实验法停药7天内死亡情况,LD50,K5, 轻度蓄积,5.3 蓄积率的测定方法,蓄积率,100,蓄积量对照组LD50预给组LD50,第六节 亚慢性和慢性毒性实验,必须先做蓄
11、积实验判断可能性 6.1 亚慢性毒性实验(1/301/20) 动物要求敏感、两种（啮齿类、非啮齿类） 健康、年幼 剂量（高、中、低） 一般取LD50的1/801/50，每天定时染毒，剂量相等 观察指标 一般指标、生化指标、病理学检查,6.2 慢性毒性实验,实验时间一般要求12年或者终生染毒 一般要求选用几种动物，年龄要小 设34个剂量组和一个对照组 LD50的1/10001/20之间取34个剂量 注意事项：指标提前观察、同步进行、注意异常情况、延长饲养时间继续观察,第七节 致癌性实验,7.1 长期动物实验 实验动物的选择：抗病力强、容易饲养、肿瘤自发率低、寿命长、对受试物敏感。两种或以上动物
12、动物数目：小型动物 50只；大型减少 剂量分组与对照（阴性、阳性对照）： 高剂量（加速致癌）、低剂量（接近人类）,染毒途径：口、皮肤、注射 实验时间：动物生命期的1/31/2 指标观测：外表、行为、X射线、病理 学检查 结果评判： 潜伏期：第一例 病理学检查：恶性、良性、癌前期变 阳性结果的判断：肿瘤数、潜伏期短,7.2 短期筛检方法,Ames实验：外源化学物致突变作用 DNA修复测定：3H-Tdr 哺乳动物细胞的体外恶性转化,Ames试验,组氨酸营养缺陷型菌株（His-） His- His+ 哺乳动物微粒体酶前致癌物,受试物,组氨酸缺乏培养基,S-9混合液,致突变物,DNA修复测定,蔗糖密度
13、梯度离心技术 切除片段大小 沉降速度 放射自显影技术 直接定位损伤部位,第八节 致突变实验,一、哺乳动物细胞突变试验 正常细胞 酶的缺失 突变细 胞能与有害物共存 突变细胞 不能与有害物共存,回复突变,正向突变,正常细胞,二、染色体畸变试验,哺乳动物体内骨髓细胞遗传学试验 人外周血淋巴细胞遗传学试验 (T、B cell),观察染色体的完整性,未分裂，G0期,加秋水仙素抑制有丝分裂，使染色体停滞在分裂中期,三、微核试验,用于检测染色体断裂剂（诱裂剂）和纺锤体毒物 小鼠或大鼠骨髓 高剂量 每只动物计数1000个以上嗜多染红细胞 评价：正常水平：单个动物 0.4；一组动物 0.3,四、致死试验,（1）生殖细胞致突变 小鼠或大鼠 试验分5组，3个实验组、阴阳对照各1组 （2）果蝇伴性隐性致死试验 F2,观察染色体的完整性,第九节 致畸性实验,给药时间 胚胎细胞开始分化和器官形成发育阶段 检查产前12天，处死 受孕动物检查、胎仔外观检查 胎仔骨骼检查、胎仔内脏检查,
