Tan基因工程的载体

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1、2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 1,本课程内容,第一章 绪论 第二章 基因克隆的工具酶 第三章 基因工程的载体 第四章 目的基因的制备 第五章 目的基因导入和重组子的筛选 第六章 外源基因的表达 第七章 基因操作的基本技术 第八章 植物基因工程及应用 第九章 动物基因工程及应用 第十章 医学基因工程及应用,2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 2,第三章 基因工程的载体,3.1 载体的功能及其特征 3.2 质粒克隆载体 3.3 病毒（噬菌体）克隆载体 3.4 酵母载体 3.5 人工染色体克隆载体,2018年9月17日10时22分,欢迎同

2、学们听课！,Slide 3,3.1 载体的功能及其特征,载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 载体：指能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。 载体的功能: 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件,作为工程载体必备的条件,具有多个单一的限制性内切酶酶切位点 有复制起点，在受体细胞中能自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。 具有筛选转化子的选择性标记基因 安全，不含对受体细胞有害的基因，

3、不会任意转入受体细胞以外的其它生物细胞中。 分子量小，拷贝数多。 携带外源基因的幅度宽,2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 4,2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 5,自主复制型载体和附加载体的扩增方式,载体的类型,应用范围：克隆载体、表达载体。 应用对象：原核载体、真核载体（酵母、植物和动物）、穿梭载体。 构建来源：质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体、质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体。,2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 6,克隆载体(cloning vector),用

4、于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建。,2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 7,表达载体(expression vector),使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载的目的基因能够复制、转录和翻译。,2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 8,穿梭载体(shuttle vector),又称双功能载体(bifunctional vector)。能在两种不同的生物体内复制的载体。 同时具有细

5、菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列(ARS)，它即能在原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。 主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基因的表达效率。,2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 9,病毒载体(virus vector),常用的动物病毒表达载体可分为两大类： 整合型（integrated）载体: 即外源基因通过这种病毒载体与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主细胞基因组的复制而扩增。这类载体的代表是 SV40PSV系列和逆转录

6、病毒逆转录病毒表达载体pLPGHL、pMSV 等。 游离型(transient)或称病毒颗粒型载体: 这类载体携带外源基因后，本质上仍然是一种完整或缺损的病毒，能够以病毒颗粒的形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。这类载体有痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒,载体从构建来源分,质粒载体 病毒或噬菌体载体 质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体 质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体,2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 11,3.2 质粒克隆载体,3.2.1 质粒的生物学特性 3.2.1.1 质粒DNA的复制 3.2.1.2 质粒DNA的不亲和性或互不相容性 3.

7、2.1.3 质粒的转移和迁移性 3.2.1.4 质粒的重组性 3.2.1.5 显性质粒和隐性质粒 3.2.2 质粒载体的构建 3.2.2.1 理想的质粒载体应具备的条件 3.2.2.2 构建质粒载体应遵循的原则 3.2.2.3 常见质粒载体及其构建 3.2.2.4 质粒载体的评价,2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 12,质粒（plasmid）,指独立存在于宿主细胞染色体外、能够自我复制的DNA分子。 广泛存在于细菌细胞中，在某些蓝藻、真菌和绿藻细胞中也发现；在酵母、眼虫、衣藻等真核生物中也存在。 绝大多数为环状双链DNA分子；极少数为线性质粒和RNA质粒。 环状双

8、链质粒DNA的三种构型： 超螺旋(SC)/共价闭合环形(cccDNA, covalently closed circular DNA)；开环(oc-DNA, open circular DNA)；线性(L-DNA, linear DNA),2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 13,2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 14,2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 15,3.2.1 质粒的生物学特性,（一）自主复制性 质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体

9、DNA而自主复制。不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不同，少则几个多则几百个不等，当然由于质粒上并没有复制酶的基因，所以其复制需要使用宿主细胞复制染色体DNA的多种酶群。 （二）不相容性 利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争，它们在单细胞中的拷贝数也会有差异，拷贝多的复制更快，结果在细菌繁殖几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。,2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 16,（三）可扩增性

10、 质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复制。pMB1或ColEI类质粒复制子的复制完全依靠宿主细胞提供的半衰期较长的复制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的产物），因此在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝，这叫做氯霉素扩增。 但另外两种质粒（psc101和p15A）的复制子的复制受质粒上编码的蛋白因子的正调节。氯霉素抑制蛋白质合成后，这类质粒便不能持续复制。,201

11、8年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 17,（四）可转移性 在天然条件下，很多天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的tra基因产物。,3.2.1.1 质粒DNA的复制,受质粒和宿主细胞双重遗传系统的控制 质粒： （1）复制起点 （2）控制质粒DNA复制强度的有关基因： cop: 指令宿主细胞合成阻遏物，阻遏物的累积阻止质粒的继续复制。 rep:指令宿主细胞合成一种调节蛋白，促进质粒的复制。 par序列: 该序列附着在细胞膜上，使质粒分子在细胞分裂时正确地分配到子细胞中，维持相对稳定的拷贝数。,2018年9月17日10时22

12、分,欢迎同学们听课！,Slide 18,松弛型和严谨型质粒,拷贝数（copies）：指一个宿主细胞内某种质粒的数量与宿主染色体数量（通常为一条染色体）之比。 严谨型质粒(stringent plasmid) :拷贝数为1至几个的质粒。 松弛型质粒(relaxed plasmid) :拷贝数多于10个的质粒。 严谨或松弛与质粒的大小及宿主类型有关。 含松弛型质粒的细菌在含氯霉素的培养基中培养时，可使质粒大量扩增。,2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 19,3.2.1.2 质粒DNA的不亲和性或互不相容性（incompatibility）,指在无选择压力的情况下，两种亲

13、缘关系密切的不同质粒不能在同一个寄主细胞中稳定共存的现象。 亲和性质粒：指能同寓于一细胞中的不同质粒。 不亲和性质粒：指不能同寓于一细胞中的不同质粒。一般为亲缘关系密切的质粒；野生型质粒与其衍生的重组质粒。,2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 20,2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 21,质粒不亲和性的机制,受相同阻遏物的制约 在细胞膜上有相同的结合位点,3.2.1.3 质粒的转移和迁移,接合质粒(conjugative plasmid)： 指质粒所携带的基因的功能是使细胞彼此有效地接触，以便将质粒DNA从供体细胞转移至受体细胞。如：质

14、粒上的tra基因使宿主细胞（大肠杆菌）产生菌毛，合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞接合。 分子较大、拷贝数少、宿主广、自行接合转移、较不安全。如：F质粒、Ti质粒等。 非接合质粒(non-conjugative plasmid)： 分子小、拷贝数多、不会自行接合转移，安全。如：ColE1质粒等。 基因工程中选用,2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 22,迁移作用(mobilization),指在接合质粒的共存下引发的非接合质粒的转移特性。 由 mob和bom两个基因控制 基因工程常利用mob和bom基因缺陷型（mob, bom ）的质粒和菌株,2018年9月1

15、7日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 23,3.2.1.4 质粒的重组性,由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。 在基因工程应用的是重组缺陷型（rec）的质粒和菌株。,2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 24,3.2.1.5 显性质粒和隐性质粒,显性质粒（表达型质粒）：指携带除与自身复制和转移相关的基因，还携带一些使宿主细胞呈现新性状基因的质粒。如： 抗抗菌素的抗性质粒（R质粒）；产大肠杆菌素（colicins）的Col质粒；引起细胞接合的育性质粒（F质粒）；降解金属有机物、芳香烃和农药等毒物降解的降解质粒；及致植物形成冠瘿瘤的Ti质粒。 隐性质粒

16、：宿主含有某种质粒，但无异样的性状表现出来，这样的质粒称隐性质粒。,2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 25,2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 26,根据质粒基因编码的特性将质粒分为五大类,Fertility /F质粒：只含有tra基因，除了促进接合转移外没有其他功能。 Resistance / R质粒：含有氯霉素、青霉素等抗性基因。如RP4，发现于假单胞杆菌。 Col 质粒：编码大肠菌素，可以杀死其他细菌，如存在于E. coli 中的CoE1。 降解质粒（Degradative plasmids）:可以降解特殊的分子如：甲苯，水杨酸。 致瘤质粒（Virulence plasmids）：农杆菌Ti质粒。,2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 27,利用抗性基因进行重组子的筛选,2018年9月17日10时22分,欢迎同学们听课！,Slide 28,3.2.2 质粒载体的构建,3.2.2.1 理想的质粒载体应具备的条件 3.2.2.2 构建质粒载体应遵循的原则 3.2.2.3 常见质粒载体及其构建 3.2.2.4 质粒载体的评价,