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1、韩 雪 蕾,哺乳动物胚胎干细胞技术,主要内容,一、胚胎干细胞的生物学特点 二、胚胎干细胞研究的意义 三、胚胎干细胞研究的历史与进展 四 .胚胎干细胞的分离培养基本程序 五.ES细胞的保存 六.ES细胞的鉴定 七.ES细胞技术目前存在的问题 八.ES细胞技术的发展方向,干细胞,功 能,组织发生,全能干细胞,多能干细胞,专能干细胞,胚胎干细胞,组织干细胞,干细胞分类,全能干细胞 Totipotent stem cells,具有无限分化潜能的细胞。可以分化成人体的各种细胞，这些细胞构成人体的各种组织器官，如胚胎干细胞。,多能干细胞 Multipotent stem cells,具有可分化出一种器官的
2、多种组织潜能的干细胞，即能够形成两种或两种以上类型细胞的干细胞。具有自我增殖和分化两种功能。,骨髓造血干细胞就是典型的多能干细胞，移植造血干细胞治疗白血病、再生障碍性贫血等血液疾病。,专能干细胞,多能干细胞进一步分化成专能干细胞，只能分化成某一类型的细胞。又称单能干细胞。如表皮干细胞只能分化产生角化表皮细胞。,胚胎性干细胞 Embryonic stem (ES) Cells,来自早期胚胎、原始生殖细胞或畸胎瘤组织等源于胚胎的干细胞，其基本特性是具有稳定地在体外自我更新、并稳定地维持正常核型和发育全能或多能性、能分化为属于外胚层、中胚层和内胚层范畴的各种类型分化细胞，甚至参与个体发育，又称为万能
3、细胞(Multipotent stem cells )。,组织干细胞 Tissue-specific stem cell,指分布在成年生物体组织中负有构建和补充某种组织细胞功能的干细胞。又称为成体干细胞(Adult stem cells)。,一、胚胎干细胞的生物学特点,1.定义 哺乳动物胚胎干细胞（Embryo Derived Stem Cells）又称ES或EK细胞，是从早期胚胎或胎儿中分离出来的具有发育全能性的细胞系。一方面具有自我更新能力，另一方面具有分化潜能。,2.来源：囊胚的内细胞团（ICM）早期胚胎的种细胞或胎儿的原始生殖细胞。 ICM在胚胎着床前：分化出原始内胚层，紧贴着囊胚腔的
4、内层生长，最后发育为卵黄膜； ICM在胚胎着床后：分化为原始外胚层，进一步分化为胚胎的3个种细胞层，进一步发育为胎儿。内消呼肝胰（内胚层发育为消化系统，呼吸系统，肝脏，胰脏） 外表感神仙（外胚层发育为表皮，感觉，神经系） 其余的是中胚层,3.细胞学特点具有胚胎细胞的特性：形态上细胞体积较小，但是细胞核较大，核质比高，核仁较大，培育时呈克隆状生长，在功能上具有发育全能型，能进行 人为定向分化。 普通细胞系的特性：在体外培养传代而不发生分化，能进行冷冻保存和遗传改造。 发育全能性：,1）形成畸胎瘤：将ES细胞接种同源动物皮下可形成内、中、外三种胚层细胞。2）形成类胚体：将ES细胞在非黏附底物中悬浮
5、培养生长，或控制增殖细胞数目，形成多种系混杂的集合体,ES 细胞全能性体现在：,3）直系分化：通过控制ES细胞生长环境或遗传操纵特定基因表达，ES细胞可直接分化为某特定种系细胞。新的ES细胞建系后在体外生长时间越短，产生所有类型组织的可能性就越大。 4）形成嵌合体：组织和器官的细胞含有两个或两个以上基因型构建而成的完整个体，称为基因嵌合体或嵌合体动物。将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中，可形成嵌合体。ES细胞或EG细胞一旦分化即丧失全能性，难以参与胚胎发育，形成嵌合体。,4.功能 在滋养层细胞上或在含有分化移植因子的介质中，能维持未分化状态，并实现自我更新，因此可以无限增殖； 在体外，在诱导因子
6、的作用下，可以定向分化；泌乳小鼠胚胎干细胞已经在体外诱导分化为神经元细胞、肝细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞黑色素细胞等。,ES细胞具有种系传递（germline transmission）能力，能够形成嵌合体动物（chimeric animal）。 若在体外把ES细胞注射至另一胚泡内，使之与受体胚胎细胞混合，再移植入假孕受体子宫，可发育获得嵌合体（chimeric）。ES细胞可参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。通过交配可以分离出带有ES细胞遗传性状的个体，这是ES细胞具有种系传递能力的一种证明。,5、ES细胞自我更新的分子机理 1、LIF（白血病抑制因子）:ES细胞表面的有一复合受体，由低亲和性
7、的LIF受体和普通亚基gp130构成异源二聚体，LIF与受体结合后激活Jak酶，通过对STAT3的磷酸化激活维持细胞自我更新的基因。,（2）转录调控因子oct-4： oct-4是ES细胞维持多能性和进入分化的开关，是DNA特异结合蛋白，通过激活或者移植靶基因的转录活性，维持ES细胞的自我更新。在ES细胞中始终保持一定的水平，表达量在50150%，才能实现自我更新和维持多能性。 Ni Wa等（2000）研究表明：STAT3和oct-4可能作用于相同的靶基因而相互协调维持ES细胞的功能。,（3）通过移植酪氨酸磷酸酶SHP-2和细胞外调节激酶ERK，维持ES的正常功能：SHP-2能除去酪氨酸上磷酸基
8、团，作用于gp130受体的胞内区，使gp130和其他的膜受体收到刺激后ERK被激活。 SHP-2和ERK对STAT3功能有负调控作用，抑制其信号传导。,二、胚胎干细胞研究的意义,1.ES细胞是研究哺乳动物个体发生发育规律极有价值的工具,2.是研究细胞分化的理想手段 ES细胞仅在饲养层细胞上或添加白血病抑制因子或白细胞介素-6家族的培养液中维持不分化状态，当培养液中添加分化诱导剂时可以出现定向分化，如视黄酸诱导分化为神经元和神经胶质细胞，DMSO诱导分化为平滑肌细胞等。 通过研究ES细胞的分化特点，可揭示细胞内信号转导的路径，发现新的信号受体，揭示细胞分化和调亡的机理。,3.研究基因功能的首选细
9、胞 由于ES细胞具有稳定的核型，并易于诱捕外源基因，因此进行基因敲除或定向插入外源基因的理想细胞。 用遗传修饰的ES细胞生产嵌合体或用细胞核移植技术获得的克隆后代，通过观察后代的表型变化，可探明未知基因的生物学功能和表达调控规律。,4.是生产转基因动物的主要方法之一 用外源基因转染后，筛选阳性细胞，然后注入到囊胚腔或其他卵裂球聚合获得嵌合体后代，用转染的ES细胞分化为生殖干细胞，生产转基因阳性动物。 也可把转化后的ES细胞作为供体核，用细胞核移植技术直接获得转基因动物。,5.ES细胞治疗技术将引起一场医学革命,人类面临的大多数医学难题,如心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病、骨质疏松、癌症、老年
10、性痴呆、帕金森病、严重烧伤、脊髓损伤和遗传性缺陷等疾病,组织工程学、功能基因组学和 蛋白质组学、发育生物学,新药开发与药效、毒性评估等,6.可用于研究细胞癌变机理和新药物的筛选 细胞癌变主要是由于正常的细胞周期发生紊乱，细胞无序增殖所致。ES细胞在正常的培养环境中能维持稳定的核型，是研究致癌物质诱发细胞癌变机理的理想材料； 在研究新药过程中，需要对药物的作用机理和药效进行研究，ES细胞在体外能分化多种体细胞，可以直接作为实验材料来筛选新药，可缩短新药开发周期，且治疗的针对性强。,三、胚胎干细胞研究的历史与进展,干细胞研究成为继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前景的生命科学科
11、研究领域； 1999年干细胞研究被美国SCIENCE杂志评为1999年度世界十大科学之冠； 2000年干细胞研究再次被SCIENCE杂志评为该年度世界十大科学成就之一。,1981年英国剑桥大学的Evans和Kaufman用延缓着床的胚泡的胚胎内细胞团ICM （inner cells mass)获得鼠的ES细胞； 同年美国的Maryin用条件培养基获得鼠的ES细胞。Roberston用不同品系的鼠胚和具有不同遗传疾病的胚胎建立了细胞系并进行了多能性和嵌合特性的分析。,1998年11月，美国威斯康星大学的科学家James Thomson等从人囊胚的内层细胞团中取得胚胎干细胞。 他们把胚胎干细胞与小
12、鼠的骨髓间质细胞进行了共培养。结果表明胚胎干细胞可以进行长达5个月的非分化增殖，同时还保持着分化为滋养层组织及三种胚层组织的能力。这为胚胎干细胞的临床应用奠定了基础。,1999年12月，美国科学家在美国科学院院刊报告说，小鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横向分化”为血液细胞。随后，世界各国的科学家相继证实，成体干细胞包括人类的成体干细胞具有可塑性。 2000年5月，日本启动“千年世纪工程”，以干细胞工程为核心技术的再生医疗成为这项工程的四大重点之一，第一年度投资金额达108亿日元。,2001年1月，英国议会上院通过法案，允许科学家克隆人类早期胚胎，并利用它进行医疗研究。 2001年4月，美国科学家
13、发现，从病人臀部和大腿处抽取的脂肪中，含有大量类似干细胞的细胞，这些细胞可以发育成健康的软骨和肌肉等。,2003年，美国卫生独立研究院（National Institutes of Health，NIH）华裔科学家施松涛等人首次发现牙齿间质存在干细胞。 2005年报出干细胞研究领域乃至全球学术界一大学术丑闻：2004及2005年韩国汉城大学教授黄禹锡有关干细胞研究的论文两次荣登Science杂志，结果经各方查证证实其论文数据存在造假现象，2006年Science杂志宣布撤回这两篇论文。,2006年，日本科学家山中亚弥等成功诱导出鼠诱导性多能干细胞（induced Pluripotent Ste
14、m Cell， iPS细胞），此项研究成功将干细胞研究扩充到一个新的领域：重编程！ 2007年，iPS研究取得巨大进展：山中亚弥等人和汤姆森带领下的华裔科学家俞君英等人分别在Cell及Science发表论文宣布成功利用人类上皮细胞诱导出iPS细胞。,2008年，美国科学家解析了microRNAs在干细胞发育及分化中的调控作用，为干细胞日后的研究提供了非常重要的参考资料。 2009年3月，美国白头研究所（Whitehead Institute）科学家在成功诱导iPS细胞后，巧妙的将诱导iPS时带入细胞的基因去除，大大降低了细胞癌变风险。 2009年3月，汤姆森和俞君英带领的研究小组在iPS研究方
15、面又迈进一大步，他们利用质粒作为诱导iPS基因的载体进行诱导iPS细胞后，随着细胞分裂丢失质粒，可以得到纯净无外源DNA的iPS细胞，在iPS细胞应用安全性方面又进一步。,四 .胚胎干细胞的分离培养基本程序,1.胚胎干细胞的分离 目前ES细胞主要有两个来源，即胚泡内细胞团和生殖嵴中的原始生殖细胞，前者更为常用。 囊胚：尽量选择体内受精的胚胎分离ES细胞；对于相同来源的胚胎选择色泽透亮，ICM明显的胚胎。 胎儿性腺脊：经酶消化后，可直接培养在分化抑制培养体系中，一般7d传代一次，直至出现细胞形态均一的克隆细胞团，挑选后进行扩大培养。,小鼠多用34天的胚泡或23天的桑椹胚，,猪取810天的胚泡，,
16、绵羊取89天的胚泡，,人和牛取78天的胚泡。,原始生 殖细胞,从胚泡中分离出细胞团的方法主要免疫外科学方法，显微外科学方法和组织培养法等。 其中组织培养法是将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，较易获得胚胎干细胞集落。,（1）免疫外科学方法：该法的原理是利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 以小鼠为例，将体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经抗小鼠脾细胞抗血清作用一定时间后再移入含新鲜豚鼠血清的培养液中处理，这样滋养层细胞即被破坏，去除死去的滋养层细胞即得ICM，将ICM离散成卵裂球即可接种培养。 此法较为简单，且去除滋养层细胞较彻底，最为常用。,（2）显微外科学方法：小鼠受精后3-4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养. （3）组织培养法:在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4-6天后，从子宫中取胚泡进行培养。滋养层细胞生长并在培养皿底壁上铺展，而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。,
