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1、基因工程原理,第二讲 基因操作的主要技术原理袁子国Sep 23，2011,核酸的凝胶电泳 它是一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，同时也是分子生物学研究方法的技术基础。,第一节 核酸的凝胶电泳,前 言一、 琼脂糖凝胶电泳 二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳 三、 脉冲场凝胶电泳,前 言,核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段；优点：（1）便于分离;（2）便于检测;（3）便于回收。,核酸凝胶电泳的基本原理,1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移； 2）由于在电泳中往往使
2、用无反应活性的稳定的支持介质，电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。而摩擦系数是分子大小（构型）、介质粘度等的函数；因此，可在同一凝胶中、一定电场强度下、可在凝胶上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。,一、 琼脂糖凝胶电泳 Agarose gel electrophoresis,琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。它是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP）琼脂糖。,（一）凝胶的制备及电泳,制胶,1.准备好凝胶成型器，插入成型梳。 2.将1.5g琼脂糖加至1
3、00 ml 1TAE缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全熔化，冷却至60以下。 3.加入5ul溴化乙锭（终浓度0.5ug/ ml ）至熔化的琼脂糖液中混匀，但避免出现气泡。 4.将冷却的琼脂糖倒入凝胶成型器，制备凝胶。,电泳,1.待胶变硬，直到它呈乳白状且不透明（约20分钟），小心垂直向上拔出梳子，将凝胶置入电泳槽中，加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。 2.用移液器吸取2l 的6X载样缓冲液于封口膜上，再加入5l样品，混匀后，小心加入点样孔。 3.接通电源，调节电压至4-5V/cm，DNA从负极移到正极。电泳时间3060分钟。 4. 电泳结束，关掉电源。,1. 将电泳完毕的琼
4、脂糖凝胶置于自动成像系统 的平台中间； 2. 开通紫外光，可见到发出荧光的DNA条带，在 电脑中观察图像； 3. 关上紫外光电源，在电脑中编辑和保存图像； 4. 根据图像判定结果。,结果分析,（二）DNA的迁移速率决定因素,1 DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比；2 琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快；,根据标准DNA相对迁移距离推测待测定 的DNA片段的大小,3 DNA的构象 一般同一分子：超螺旋环状线状切口环状。4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。,Agarose gel elect
5、rophoresis,5 所用的电压低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。6 琼脂糖种类常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；,不同类型琼脂糖的性质,不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围,7 电泳缓冲液常用的有TAE、TPE及TBE,TAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较,都是常用电泳缓冲液。三者相比： 1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化； 2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量； 3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%； 4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，对于低分子质量的
6、DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。,（二） 凝胶载样缓冲液,载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液。 载样缓冲液有三个作用： 1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内； 2）使样品带有颜色便于简化上样过程； 3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。,6凝胶载样缓冲液,（三）琼脂糖凝胶中DNA的检测,通过染色, 紫外灯下检测。主要有溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染色法和SYBR Gold染色法。,1 凝胶的EB染色,观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色，溴化乙锭含有一个可
7、以嵌DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。,在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍，所以当凝胶中含有游
8、离的溴化乙锭（0.5ug/ml）时，可以检测到少至10ng的DNA条带。,溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA）。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其荧光产率也相对较低。事实上，大多数对单链DNA或RNA染色的荧光是通过染料结合到分子内形成较短的链内螺旋产生的。 尽管在该染料存在的情况下，线状DNA的电泳迁移率约降低15%，因此，当需要知道DNA片段的准确大小（如DNA限制酶酶切图谱的鉴定），凝胶应该在无EB情况下电泳，电泳结束后用EB染色。染色完毕后，通常不需要脱色。但是在检测小量DNA（小于10ng）片段时，通常要将染色后的凝胶进行脱色。,使用EB染色注意事项,（1）E
9、B被认为是一种强致癌物质 （2）EB可用来检测单链或双链核酸,（3）EB使用时的配制、贮存及使用EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 g/ml 。,（4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。,EB替代品,sybr-green- 不稳定，易降解 goldview -宣称无毒,不灵敏,回收连接不好,对大片段的DNA染色还可以，荧光易猝灭 gelred - 低毒,效果很强!但价格昂贵 genefinder - 效果一般，以前怀疑它是sybr green genegreen -不稳定，易降解,ge
10、lRed & gelGreen的凝胶染色,它们是一种新型极敏感染料的商品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。,（四） 凝胶中DNA的成像,可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察。,（五） 凝胶中DNA的回收,现一般采用试剂盒回收：存在的主要问题： 1 不能有效的回收大片段DNA 2 不能有效回收少量DNA,二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamide gel electrophoresis PAGE,在TEMED (四甲基乙二胺)催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。在双
11、功能交联剂如N，N-亚甲基双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构。网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。,（一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质,CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺）CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2（N，N-亚甲双丙烯酰胺）,（二） 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类,1 变性聚丙烯酰胺凝胶用于单链DNA片段的分离或纯化。变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。用途：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。,2 非变性聚丙烯酰胺凝胶用于双链DNA片段的分离和纯化。注：迁移率受其碱基组成和序列的影
12、响。用途：制备高纯度的DNA片段。,（三）DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围,三、 脉冲场凝胶电泳 （pulsed-field gel electrophoresis， PFGE）,为何选PFGE？超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长度（40kb）后DNA的迁移速率几乎与分子大小无关，而主要决定于电场强度。但 PEGE 解决了这一问题。,（一）脉冲电场凝胶电泳基本原理 1984年，D.R.Cantor发明的。分离超大分子量的DNA分子。 在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45度角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在
13、另一侧成45 度角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。 107bp的DNA大分子,脉冲电场电泳示意图,PFGE can resolve large DNA fragments,（二）PEGE类型,垂直脉冲场电泳系统(vertical pulsed field) 场翻转系统(field inversion) 旋转胶系统(ro
14、tating gel) 箝位匀强电场系统(contour-clamped homogeneous electric field),垂直交变电场系统,场翻转系统,箝位匀强电场系统,旋转胶系统,（三） 影响分辨率的因素,1 脉冲时间（0.1s-1000s)：增加脉冲时间分离较大分子，减少脉冲时间分离较小分子。 2 电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度会导致较小片段泳动的紊乱。,3 电场夹角：电场方向的夹角常为1100 - 1200，研究证实900夹角也非常有效的。 4 温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行，PFGE一般应在4 进行。较高的温度DNA泳动较
15、快；但是较高的温度也引起较小片段的泳动截留和明显的条带变宽。,核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNA）技术核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。,杂种核酸分子：彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，而形成的双链分子。DNA/DNA的杂交作用 检测特定生物有机体之间的亲源关系DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片段中某种特定基因的位置。,
16、核酸杂交常用几种膜的性能比较,硝酸纤维素膜不能滞留小于150bp的DNA片段，不能同RNA结合。应用1mol/L醋酸铵和0.2mol/L的NaOH缓冲液代替SSC缓冲液可改善对小片段DNA的滞留能力。RNA变性后也能十分容易的结合到膜上。,尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤：1. 核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体支持膜上。利用的是毛细管作用2. 印迹杂交： 将具有核酸印迹的滤膜同带有标记的DNA/RNA进行杂交。,1、萨瑟恩DNA印迹杂交根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫Southern DNA 印迹转移技术。,印迹转移前的凝胶处理：分子量不同所需转移的时间不同；浸泡在0.25M的HCl溶液中脱嘌呤，再进行碱变性碱水解，DNA链断裂单链,
