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1、工具酶的发现和基因工程的诞生,第一章 第一节,学习要求,第一个人工DNA重组产物,第一个成功的基因克隆实验,美国斯坦福大学的科学家首次用一种限制性核酸内切酶切割猿猴病毒SV40的DNA和噬菌体DNA，然后用DNA连接酶对切开DNA进行连接，形成了重组DNA分子。,将两种来自大肠杆菌的含四环素抗性基因的质粒和含卡那霉素抗性基因的质粒分别用同一种限制性核酸内切酶切割，然后DNA连接酶连接，形成的重组DNA分子转入大肠杆菌后，大肠杆菌同时具有抗四环素和抗卡那霉素的性状。,基因工程诞生于20世纪70年代,理论基础,技术保障,DNA 是生物遗传物质的发现 DNA双螺旋结构的确立 遗传信息传递方式的认定,
2、限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒载体的发现与运用,什么叫基因工程？,基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。该技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。,（一）基因工程的概念,（一）基因工程的概念,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的基因产物,剪切, 拼接, 导入, 表达,实质,基因重组,基因工程需要哪些工具？,（二）基因操作的工具,基因的剪刀限制性核酸内切酶 基因的针线DNA连接酶 基因的运载工具运载体,基因的剪
3、刀限制性核酸内切酶,（二）基因操作的工具,限制酶能够识别和切割DNA内一小段核苷酸序列的酶。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。特点：特异性。即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。,基因的剪刀限制性核酸内切酶,（二）基因操作的工具,大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,限制性核酸内切酶,基因的剪刀限制性核酸内切酶,（二）基因操作的工具,限制性核酸内切酶,什么叫粘性末端？,（二）基因操作的工具,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫粘性
4、末端。,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制性核酸内切酶切几个切口？可产生几个粘性末端？,（二）基因操作的工具,要切两个切口，产生四个粘性末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的粘性末端，然后让两者的粘性末端粘合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,基因的针线DNA连接酶,（二）基因操作的工具,DNA连接酶可把粘性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把具有末端碱基互补的两个DNA分子连接起来，形成的DNA就称为重组DNA分子。,DNA聚合酶,外源基因(如抗虫基因)怎样才能导入受体细胞(如棉花细胞)？,（二）基因操作的工具,导入过程需要运输工具载体。,载体
5、的作用有哪些？,作用一：作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。 作用二：利用运载体在受体细胞(棉花细胞)内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。,作为载体必须具备哪些条件？,（二）基因操作的工具,1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 2）具多个限制性核酸内切酶切点，以便与外源基因连接。 3）具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。 4）必须是安全的。 5) 大小应适合。,基因的运载工具载体：,（二）基因操作的工具,常用的载体主要有两类：1）细菌细胞质的质粒2）噬菌体或某些动植物病毒,质粒：,（二）基因操作的工具,质粒是染色体
6、外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中核区外的DNA分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核（核区）以外的DNA分子。质粒是基因工程最常用的载体。绝大多数细菌质粒都是闭合双链环状DNA分子。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。,大肠杆菌的质粒：,（二）基因操作的工具,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如抗四环素的标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但质粒的复制只能在宿主细胞内完成。,基因工程原理和技术,第一章 第二节,学习要求,五个基本步骤：,（三）基因操作的基本步骤,1）提取目的基因 2）形成重组DNA分子 3）
7、将重组DNA分子导入受体细胞 4）筛选含有目的基因的受体细胞 5）目的基因的表达,目的基因,一、目的基因的获得,目的基因是人们所需要转移或改造的基因。,如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,1、化学方法合成2、利用PCR技术扩增目的基因 3、从基因文库中获取目的基因,一、目的基因的获得,获取方法,反转录法 根据已知的氨基酸序列合成DNA,1）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA(cDNA),双
8、链DNA (即目的基因),反转录,合成,一、目的基因的获得,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,一、目的基因的获得,3)从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,一、目的基因的获得,某生物体内全部DNA,许多DNA片段,受体菌群体,3）
9、从基因文库中获取目的基因,基因组文库,某种生物某个时期的mRNA,cDNA,受体菌群体,部分基因文库 （cDNA文库）,鸟枪法（散弹射击法）：用限制性核酸内切酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的外源DNA的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（即扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再利用一定的方法将目的基因的DNA片段分离出来。,一、目的基因的获得,4）利用PCR技术扩增目的基因,聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。,循环,二、目的基因与运载体结合,1）用一定的限制酶
10、切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,三、目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短
11、的时间内就能获得大量的目的基因。,三、目的基因导入受体细胞,例如，用质粒作为载体，宿主细胞应该选择大肠杆菌。,四、筛选含有目的基因的受体细胞,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,五、目的基因的表达,受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。,1）以下说法正确的是 （ ）A、所有的限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制性核酸内切酶切点，以便与外源基因连接D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,练习,2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制 （ ）B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因D、它是环状DNA,D,练习,3）有关基因工程的叙述正确的是 （ ）A、限制性核酸内切酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,练习,4）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ）A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达,C,练习,
