++目的基因的分离与克隆

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1、,中国科学院学科基础课,Principles of Genetic Engineering 基 因 工 程 原 理,中国科学院研究生院 吴亮其,质粒载体,噬菌体载体,大分子DNA克隆载体,基因打靶载体,病毒载体,第四讲 基因克隆的载体与受体,用于基因转移的受体菌或细胞,基因工程原理纲要,第一讲 基因工程概论 第二讲 基因工程的主要技术 第三讲 基因工程的酶学基础 第四讲 基因克隆的载体与受体 第五讲 目的基因的分离与克隆 第六讲 克隆基因的检测与鉴定 第七讲 基因表达调节与产物纯化 第八讲 从原核到真核基因工程,第五讲 目的基因的分离与克隆,第一节 基因组DNA片断化 第二节 化学合成目的基因

2、 第三节 目的基因的保存与文库构建 第四节 目的基因的分离和扩增 第五节 DNA片段的体外连接 第六节 重组体导入细菌细胞 第七节 外源基因导入真核细胞,第一节 基因组DNA片断化,一、限制性内切酶法,用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。,酶切,由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。,1. 优点,2. 缺点,目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！,BamH I,BamH I,BamH I,gene,二、随机片断化,1. 限制性内切酶局部消化法,控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。, 内切酶识别位点的碱基数,影响所切出的产物的

3、长度和随机程度。,（1）限制性内切酶的选用原则,1）4bp的内切酶,平均每46（4096）bp一个切点。,2）6bp的内切酶,平均每44（256）bp一个切点。,随机程度高。如Hae、AluI、Sau3A。, 内切酶粘性末端,能与常用克隆位点相连。,（Sau3ABamH I）,2. 机械切割法,（1）超声波,超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。,（2）高速搅拌,1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。,1967年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在Science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。

4、,第二节 化学合成目的基因,目前常用的方法,磷酸二酯法、,磷酸三酯法、,亚磷酸三酯法、,固相合成法,自动化合成法。,（详见第二讲）,将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。,一、基因文库的构建,1. 基因文库（gene library）,第三节 目的基因的保存与文库构建,（2）目前常用的载体,2. 构建基因文库的载体选用,载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。,载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的

5、重组子越少。,（1）对载体的要求,载体系列： 容量为 24 kb cosmid载体： 容量为 50 kb YAC： 容量为 1 Mb BAC: 容量为 300 kb,断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。,（1）染色体DNA大片段的制备,3. 基因文库构建的一般步骤,超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。, 物理切割法：,内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。, 酶切法：,（2）载体与基因组DNA大片段的连接, 粘性末端直接连接,载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。,如：Sau3A与BamH I的酶切末端。,直接连接、

6、人工接头或同聚物加尾。,人工接头法（adapter）,人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。,各种酶的接头可以向公司定做或购买。,接上人工接头,粘性末端,CCC,CCC,末端转移酶,粘性末端, 同聚物加尾,4. 基因组文库的大小,一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。,N=,ln (1-p),ln (1-f),p: 文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）,f: 插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因 组DNA的百分数,N：所需的重组载体数（克隆数）,例如：人的基因组是 3109 bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7104 bp,N=,ln (1-p),ln (1-f)

7、,=,ln (1-99%),ln (1-f),=,4.61,G,f,N=,4.61,G,f,G：Genome大小；f：fragment大小,N=,4.61,G,f,=,4.61,3109,1.7104,= 8.1105,1. cDNA,以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。,2. cDNA library,二、 cDNA文库的构建,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。,（1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含了所有编码蛋白质的基因。 （4

8、）比DNA文库小的多，容易构建。,4. 构建cDNA文库的一般步骤,（1）总RNA（total RNA）提取,3. cDNA文库的特点,提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。,分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。,利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。 mRNA只占总RNA的1%-2%。,（2）mRNA的分离纯化, 原理, mRNA的分离纯化,Column（柱）,反转录酶,（3）cDNA的合成, cDNA第一链合成,逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。 用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。,mRNA,

9、cDNA,3,5,5,AAAAAAA,TTTTTTT,Oligo dT引物,用碱处理或用RNase H降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,mRNA,cDNA第一链,3,3,5,5,引物,cDNA第一链,3,5,引物, 降解mRNA模板,或RNaseH,碱,剩下的cDNA单链的3末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。,cDNA第一链,5,cDNA第二链合成,DNA聚合酶,cDNA第一链,cDNA第二链,5,3, cDNA第二链合成,去掉发卡结构,核酸酶S1,用

10、核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。,cDNA第一链,cDNA第二链,5,3,cDNA第一链,cDNA第二链,5,3,5,3,这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。,妙用RNaseH,小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。,DNA Pol I除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。,mRNA,cDNA,3,5,反转录酶,引物,mRNA,cDNA第一链,3,5,引物,mRNA,cDNA第一链,3,5,mRNA,mRNA,DNA 聚合酶,DNA 聚合酶,cDNA第二链,cDNA第一链,3,5,RNa

11、seH,DNA ligase,去引物,在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3端分别加上几个C或G，成为粘性末端。,5. cDNA与载体连接：,接上人工接头,粘性末端,CCC,CCC,末端转移酶,6. cDNA文库的大小,一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。,N=,ln (1-p),ln (1- ),p: 文库包含了完整mRNA的概率（99%）,: 某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例,N：所需的重组载体数（克隆数）,1,n,1,n,三、文库的查询（screening）,用目的基因探针

12、与文库中的重组载体进行Southern blot杂交。,文库,载体,探针,电泳后杂交放射自显影,测序分析,第四节 目的基因的分离和扩增,一、目的基因的分离,1. 探针柱分离特异mRNA,根据已知的基因序列合成探针，结合到纤维素柱上，用来分离纯化该基因的mRNA。,富集特定基因的mRNA或cDNA模板。,纤 维 柱,探针DNA,探针DNA,探针DNA,探针DNA,Total mRNA,纤 维 柱,探针DNA,探针DNA,探针DNA,探针DNA,过柱,与探针碱基互补的mRNA结合到柱上，其它mRNA流走。,特异mRNA,洗脱,RT-PCR,2. mRNA消解杂交,原理：,羟基磷灰石柱,结合单链DN

13、A-RNA或DNA-DNA双链，不结合单链DNA。,（Hydroxylapatite column）,从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA。 将表达A蛋白的mRNA合成cDNA第一链。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。 不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。 用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。,A,A,A组织,B组织,总mRNA（A）,总mRNA（B）,含蛋白A的mRNA,不含蛋白A的mRNA,总cDNA第一链,A,杂交,内含蛋白A 的cDNA,羟磷灰石柱,过柱,吸收RNA-DNA,单链滤过,

14、羟磷灰石柱,B,A,PCR,cDNA文库,3. mRNA差异显示PCR（DD RT-PCR）,mRNA differential display RT-PCR,（1）3端的锚定引物,Oligo(dT)引物的3端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。,AAAAAAAAAAAAAAAA,mRNA,3,5,NM,TTTTTTTT,M：A、G or C N: A、G、T or C,5,3,（2）12种锚定引物,AG,TTTTTTTT,5,3,CG,TTTTTTTT,5,3,GG,TTTTTTTT,5,3,TG,TTTTTTTT,5,3,AA,TTTTTTTT,5,3,CA,TTTTTTTT,5,3,GA

15、,TTTTTTTT,5,3,TA,TTTTTTTT,5,3,AC,TTTTTTTT,5,3,CC,TTTTTTTT,5,3,GC,TTTTTTTT,5,3,TC,TTTTTTTT,5,3,（3）5端的随机引物,10 mer,AAAAAAAAAAAAAAAA,mRNA,3,5,NM,TTTTTTTT,5,3,扩增cDNA第一链。,RT,NM,TTTTTTTT,5,cDNA,3,NNNNNNNNNN,5,3,NNNNNNNNNN,5,3,cDNA第二链，并PCR,（4）随机引物与锚定引物成对扩增,12种锚定引物，若与20种随机引物，可组成240组引物。,引物组合：,240组能分出20000多条带！,实验结果：,如果每条带相当于一种mRNA，20000 mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的mRNA。,在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。,（5）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较,