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1、体外培养的原理与技术,医科大学组胚教研室,体外培养的基本原理与技术,一、从体内生存环境到体外生长条件,二、体外培养的基本方法和过程,三、体外培养物的生长生物学,四、细胞分离与纯化,五、细胞系（株）、细胞克隆,六、培养物的观察检测方法,四、细胞分离与纯化,从有机体组织分离得到的细胞悬液以及从动物体液获得的细胞一般都包含多种细胞成分，为异质性的混合物。 而进行体外细胞培养的目的，不外乎研究特定细胞的特性、功能或其它特殊用途，故一般必须获取分离开的和尽可能均一的细胞群体。 在进行体外细胞培养时，不仅要将拟培养组织材料制备成分离（离散）的细胞（dissociated cell），以细胞悬液的形式接种并
2、培养，更重要的是从所制备的细胞悬液中分离(separation or isolation)出成分尽可能单一的细胞用于培养。,细胞分离（cell separation) 指的是将组织材料分散制成细胞悬液后，从中获取目的细胞的过程。（细胞分离是针对于细胞成分而言，而不针对生物化学成分）。 细胞纯化（cell purification) 强调从原代培养前、成分混杂的异质性细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。通过细胞分离和纯化过程，使得培养物成为单一型培养物，甚至是遗传特性完全一致的培养物，后者即细胞系（cell line）或细胞株。,四、细胞分离与纯化,分离和纯化两概念之间没有截然的界限
3、。许多情况下，细胞分离和纯化并不是完全彻底的，培养物中只能达到以某种细胞为主（占绝大多数）的程度，所以也常称为富集（enrichment）。 分离和纯化细胞的过程不仅仅是在原代培养之前进行，有时候，分离和纯化细胞的过程还贯穿在原代与继代培养的过程之中，甚至主要依靠培养过程实现分离与纯化细胞的目的。 培养物中细胞成分是否单一或者目的细胞在培养物中的比例如何，常常是衡量某一培养工作是否成功的重要指标。,四、细胞分离与纯化,根据所要分离纯化的对象和目的不同，可以采用不同的细胞分离纯化方法，从简单的手工操作技术到使用自动控制的特别是电脑控制的尖端仪器。 从成分混杂的细胞悬液中将不同的细胞区分开来达到分
4、离纯化，主要是根据不同的细胞所具有的各种各样特性而实现的，或者是利用细胞的物理特性如密度、体积、电荷等，或者是利用细胞的生物学特性如特异性表面标志和功能。,四、细胞分离与纯化,1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离,2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,3.根据细胞表面电荷的细胞分离方法,4.基于不同黏附特性的细胞分离方法,5.利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法,6.利用其它细胞学特性分离纯化细胞的方法,四、细胞分离与纯化,1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离,将用于体外细胞培养的动物组织材料制备成细胞悬液，然后接种并培养，是原代培养的最常规方法。 由于从体内切取的大多数
5、组织（少数结缔组织如血液、骨髓、淋巴等除外），均是由细胞和少量的细胞间质（后者内一般含有纤维成分）紧密结合而成的实体组织。如果直接将所取的组织块用来培养（此即为植块培养），在培养的组织块大于1 mm3时，培养过程中只有位于植块周边的细胞容易获得营养而存活和生长发育。,1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离,由于受组织内部的纤维成分的束缚，能够从植块内部迁移出来的细胞很少。大部分位于植块内部的细胞会因营养物质和气体渗透困难而缺乏营养和O2供应，以致生长发育不良或者死亡，这也是植块培养法难以进行长期体外培养的主要原因。,为了获得大量细胞培养物，必须将组织解离，将组织块内部细胞与细胞之间的“
6、组织关系”解除，将细胞“解放”，使之成为分离（离散）的细胞，这个过程即为细胞分离（离散）或分散（cell dissociation)。 细胞分离（离散）或分散并不等于细胞分离和纯化，但是，细胞分散是细胞纯化的前提。目前所建立的体外分离和纯化细胞的方法，绝大多数是从细胞悬液中进行分离和纯化的。 将所切取的组织制备成细胞悬液，是细胞分离和纯化的基础。,1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离,如何通过不同的机械分离与酶学解离方法实现对目的细胞一定程度的分离纯化呢？ 一方面，可根据所取组织的细胞构成，尤其是细胞的大小不同进行分离纯化；另一方面，根据不同组织的细胞间质特性不同而实现。 在每一次培
7、养接种时，应尽量先以各种方法使得细胞悬液中目的细胞之比例提高。 为实现此目的，可从下列步骤的进行中最大限度地获得目的细胞。,1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离,（1）取材 取材是整个体外培养过程的开始。准确的取材是获得某一特定培养对象的关键。 在切取动物组织块时，要尽量剔除所附带的其它组织和残余结构。（2）机械分离过程 在机械分离所取组织的过程中，能够进行初步的细胞分离纯化的手段之一，就是按照组织内不同细胞的大小差异，以一定孔径的不锈钢或尼龙筛网过滤细胞。 1)网搓法： 2）细胞悬液过滤：,1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离,（3）用酶学方法分离纯化 用酶学方法达到部分
8、分离纯化的主要依据是：不同组织的细胞和间质的构成不同。例如，上皮组织的细胞间质少，间质内的纤维成分少，最有效的蛋白酶是胰蛋白酶。而结缔组织、肌肉组织的细胞间质中纤维成分较多。要消化结缔组织、肌肉组织中的间质成分，需要使用胶原酶和其它酶，胰蛋白酶的消化作用不明显。（4）培养过程中的选择性分离在体外分散细胞培养过程中，培养物本身有一种自然纯化的特性。 1) 机械刮除法： 2）选择性酶消化法：,1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离,2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,细胞可视为一种完整的颗粒并且表现出与此有关的物理性状。不同类型细胞的物理性状可能互不相同，这些差异正是部分或完全地分离
9、纯化细胞的依据之一。 基于物理性状的细胞分离纯化技术，由于无需对细胞进行化学处理，也不像多数生物学方法那样需要抗原抗体、受体配体相互作用，故可避免细胞发生变化，因而这类技术具有其自身的优越性。 细胞分离纯化中最常利用的物理性状是细胞的体积（大小）、密度和表面电荷。,利用细胞体积和密度进行分离纯化的技术均基于沉降作用。不同类型细胞往往具有不同的体积和密度，可以采用沉降技术将其分离开来。其基本原理是，悬液中细胞的沉降率与细胞体积、细胞密度和其周围介质密度之差成正比。 应用沉降技术，使之沉降的细胞的密度应该比介质大，而使之漂浮的细胞的密度则应比介质小。因此，实施沉降技术分离纯化细胞的关键在于选择密度
10、梯度形成介质，故沉降技术也称为密度梯度（离心）技术。,2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,选择密度梯度形成介质的一般原则是： 所形成溶液的密度应包括所需要的密度范围； 形成的溶液黏度较低； 具有某些性质如折射率，据此可测定它的浓度（或密度）； 不损伤细胞或不改变细胞的生物学特性； 离心分离后易于除去； 不妨碍分离组分的分析。 按照上述原则来选择，分离细胞常用的密度梯度形成介质有： （1）牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA) （2）聚蔗糖（polysucrose） （3）泛影酸盐（Diatrizoate） （4）硅胶颗粒,2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法
11、,（1）牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA) 由于BSA是血清蛋白，它对细胞活性的影响很小，是早期应用连续或不连续密度梯度分离细胞的最常用介质，但BSA黏度很高，分离细胞必须长时间离心，且用量大，费用高，故现在已经部分被其它分离介质取代。 （2）聚蔗糖（poly-sucrose） 是一种合成的蔗糖聚合物，商品名叫Ficoll,常用的是：Mr400 000 Pa,名为Ficoll 400。 Ficoll不渗入生物膜，渗透压也很小，不影响细胞活性和酶活性，但其渗透毒性有随浓度成指数增加的趋势，且高浓度Ficoll溶液的黏度大，可导致细胞凝集，故常以低浓度Ficoll和其
12、它物质如泛影酸盐合用以增加溶液的密度。Ficoll 400是目前常用的细胞分离介质之一，商品含量为40（wV），也可用Ficoll干粉来配制。,2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,（3）泛影酸盐 泛影酸盐离子强度低，可配制成高密度而低渗透毒性的溶液，而且黏度比Ficoll小，很适合密度梯度分离细胞，常与Ficoll配合使用。 国外常用商品Isopaque或称Triasil (sodium metrizoate)和Hypaque (sodium diatrizoate），与Ficoll配制的溶液商品名为Ficoll-Isopaque(Triosil
13、)或Ficoll-Hypaque，泛影酸盐价格较贵。 国内常用造影剂泛影葡胺（meglumini diatrizoici）代替，其商品名为Urografin,含量通常为60%或75%,其与Ficoll配制的溶液商品名是淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），密度1.077士0.001，主要用于人单个核细胞的分离。,2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,（4）硅胶颗粒用聚乙烯毗咯烷酮（polyvinylpyrolidone, PVP)包被硅胶颗粒，商品名为Percoll。 Percoll具有以下优点： 稳定性很好，可长期保存； 密度稀释范围较大，可包括大多数哺乳动物细胞的密度； 在溶液内产生的渗透压
14、很小，故在全部密度范围内能保持等张； 黏度低，即使在最大密度时也是如此，因此用较小的离心力和较短的时间就可达良好的分离效果； 对细胞无毒性，且易于从细胞制剂中洗涤除去； 在高速离心（10，000 r/min)时，可形成连续密度梯度； 价廉，分离细胞时用量少。因此，Percoll是一种很优良的分离介质，是现在用于分离多种哺乳动物细胞的最常用介质之一。商品Percoll的密度一般为（1.13士0.005）,2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,不同细胞的分离方法：,A.一步密度梯度离心法,B.等密度梯度离心法,C.速度沉降法,D.离心淘析分离技术,血细胞的分离 玫瑰花环细胞的分离,连续BSA密
15、度梯度离心法 非连续BSA密度梯度离心法 连续Percoll密度梯度离心法 非连续Percoll密度梯度离心法,低速离心速度沉降法 单位重力沉降法 简单重力沉降法分离白细胞与红细胞 简单重力沉降法分离粒细胞,2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,A.一步密度梯度离心法：,一步密度梯度离心法分离细胞的依据是细胞的密度和体积。 将细胞悬液加于一种高密度介质上，应用低速离心，密度大于介质的细胞通过介质而沉淀于管底，而密度低于介质的细胞则滞留于介质之上，体积较大的细胞沉降较快，体积较小的细胞沉降较慢，从而将具有不同密度和大小的细胞分离开来。 一步密度梯度离心法常用于分离血细胞和形成玫瑰花环的淋巴细
16、胞。 一步密度梯度法常用的分离介质是：Ficoll-Hypaque,也可用Percoll,动物血清,BSA等。,2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,B.等密度梯度离心法,等密度梯度离心法分离细胞的依据是细胞的密度。 在等密度连续梯度分离中，细胞在强离心力的作用下，通过密度逐渐增高的介质沉降，当其到达某一沉降距离，细胞的密度恰好等于梯度介质的密度，因此沉降速度为0。 在平衡状态下，细胞在此特定位置形成一条区带而不再继续沉降，所以具有不同密度的细胞群体便在梯度介质的不同位置上形成区带。 因此，等密度梯度离心法分离细胞仅仅依赖于细胞的密度。反过来，通过测定细胞停留处梯度介质的密度，可以确定细胞的密度。,2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,B.等密度梯度离心法,非连续密度梯度离心法分离细胞的原理与连续密度梯度离心法是相同的，但细胞集中在介质和介质之间的界面上。 等密度梯度离心法采用强离心力，其目的仅仅是加快达到平衡的速度和减少扩散的混合效应。 虽然细胞体积的大小可影响建立平衡的速度，但不影响达到平衡时细胞在梯度上所处的位置。 应用本技术分离细胞常用的梯度介质有BSA和Percoll。因为建立平衡的速度与介质的黏度成反比，故采用Percoll等低黏度介质所制备的密度梯度离心分离细胞，可在低离心力、短时间内达到平衡。,
