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1、第三章：分子生物学技术应用,农业生物学实验教学中心,第一节：PCR技术在植保上的应用,PCR的反应原理PCR的类型和应用PCR示例,多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction),Kary B. Mullis,PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种 体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA 快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝 尔化学奖。,体内DNA的复制体系,DNA聚合酶（I II III）,拓扑异构酶 解旋酶类 SSB,引物 dNTP Mg2+,Mullis的PCR构思,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),4
2、0 50 60 70 80 90 100,10080604020,耐热DNA聚合酶,Saiki（1988）将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。,PCR反应循环,PCR反应循环,Taq,P1,P2,PCR反应体系,dATP,dTTP,dGTP,dCTP,Mg2+,模板：DNA 引物：P1 P2 DNA聚合酶：Taq 原料：dNTP 反应缓冲液 辅助因子：Mg2+,模板 引物 Taq DNA聚合酶 dNTP Mg2+,PCR反应条件,1 PCR反应的五要素,1 PCR反应成分,（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。DN
3、A模板一般100ng /100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,PCR反应条件,（2）引物引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度，理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 引物浓度：0.1-0.5 mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。,引物设计的原则,引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，ATGC最好随机分布，避免5
4、个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体。 引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。,（3）Taq DNA聚合酶0.5-2.5 U/50 l酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 （4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过
5、低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。,（5） Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。适宜浓度为0.5-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,2 循环参数（反应条件） 变性 使双链DNA解链为单链 一般9394lmin足以使模板DNA变性 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。,引物的退火温度,T
6、m值（解链温度） 退火温度=Tm值-（510） 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性 退火时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合,（3）延伸70-75,一般为72延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加,PCR技术的特点,1 ）高度的灵敏性,30轮循环,扩增量达230个拷贝,PCR产物每轮循环增加一倍,2）特异性,引物,引物,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；
7、同时尽可能减少非特异性扩增。,3）操作简便易行,利用PCR扩增,只需要数小时,就可以扩增出 可用电泳法检出的DNA，可用于检测基因组中仅含数个拷贝的模板序列。,不需分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总 RNA 均可作为扩增模板,4）操作简便易行,1）RT-pcr(反转录PCR),PCR的类型,原理： 利用逆转录酶能将RNA逆转录成DNA的特性，通过合适的引物，将细胞内的RNA（一般为mRNA)逆转录成cDNA， 然后，通过PCR技术，将痕量的cDNA扩增成大量的双链DNA。 获得的dsDNA可通过测序获得目的基因，也可用于基因操作。,逆转录步骤,RNA链，一般利用polyT作为引物，也
8、可用特异性的序列作为引物，反转录成互补的cDNA,G U A A U C C U CAAAAAAAAAAAAAAA,Reverse transcriptase,mRNA,cDNA,T T A G G A G,TTTTTTTTTTTTTTT,逆转录polyT引物,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,2）免疫PCR（immuno polymerase chain reaction , IPCR ）,是用一段已知DNA 分子标记抗体作为探针,用此探针与待测抗原反应,PCR 扩增粘附在抗原抗体复合物上的这段DNA 分子,电泳定性,根据特异性PCR 产物的有无,来判断待测抗原是否
9、存在。,免疫PCR主要由两个部分组成，第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验(ELISA)的测定过程;第二部分即通常的PCR检测，抗原分子的量最终由PCR产物的多少来反映。,3）原位,原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列。,操作步骤 1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试
10、剂（包括引物和Taq酶）进入 2. PCR扩增细胞内目的片段 3. 原位杂交检测扩增产物,A.阳性对照,B.阴性对照,C.原位检测mRNA表达,先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量 ,然后再用一对内引物扩增以得到特异的 PCR带 ,此为巢式 PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式 PCR。,4）巢式PCR（Nest-PCR）,第一次 PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度 ,这样在第一次 PCR时 ,由于较高退火温度下内引物不能与模板结合 ,故只有外引物扩增产物 ,经过若干次循环 ,待外引物基本消耗尽 ,无需取出第一次PCR产物 ,只需降低退火即可直接进行 PCR扩增。这
11、不仅减少操作步骤 ,同时也降低了交叉污染的机会。这种 PCR称中途进退式。,5) 荧光定量 PCR（real-time PCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。,内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针Taqman Molecular BeaconsDual Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen),SYBR-Green I,实时荧光定量PCR仪,梯度PCR仪,普通PCR仪,PCR技术在植物病害诊断、检测及病原鉴定中的应用,植
12、物病原真菌、细菌的分子鉴定 核糖体DNA(rDNA)的转录间隔区(ITS)序列的应用rDNA的特点是，它在病原基因组中的高拷贝、保守性，但不同生物间具有细微的差别，,真菌核糖体不同序列分类等级,16s rDNA分子已作为一个分子指标广泛地用于细菌的遗传特征和分子差异的研究,加上大量已知细菌的DNA都被测定并输入国际基因数据库,它已成为对细菌鉴定与分类非常有用的参照系统,从而可以通过对未知细菌DNA序列的测定和比较分析达到对其进行快速有效鉴定和分类的目的。,PCR技术在植物病害诊断中的应用,独有基因:例如，土壤杆菌属细菌(Agrbacteruim) 质粒:番茄溃疡病菌质粒上的一段特异区段Pat一I，并据此设计引物用以区分番茄溃疡病菌的致病和非致病株系。 核糖体 转录间隔区(ITS) 病毒的外壳蛋白基因,The End！,
