《农杆菌介导甜高粱bar基因再生体系建立及水稻eis基因转化概述》由会员分享，可在线阅读，更多相关《农杆菌介导甜高粱bar基因再生体系建立及水稻eis基因转化概述（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 农杆菌介导甜高粱 Bar 基因再生体系建立 及水稻 EIS 基因转化概述 第一章 引言1 甜高粱研究概况甜高粱(Sorghum bicolor(L.)Moench)属禾本科(Poaceae)高粱族 (Andropogoneae)高粱属(Sorghum)，也称糖高粱，是普通高粱的一个 变种。甜高粱属 C4 植物，具有光合效率高、生物产量高、抗旱、 耐涝、耐贫瘠、耐盐碱和适应性广等特性，被誉为植物中的 骆驼，在热带、亚热带和温带均可种植，主要种植在热带干 旱、半干旱地区、高海拔低温山区及盐碱地区和土壤贫瘠地等地区 黎大爵，1992；杨文华等，2004）。甜高粱是一种多用途杂粮作物， 其籽粒可以食
2、用和酿酒；茎秆汁液丰富、含糖量高，可用于加工生 产糖和糖浆，还可用作青贮饲料或加工成糖化秸秆饲料，最重要的 是可以用来生产乙醇，代替石油等化石燃料，缓解全球能源危机王 艳秋等，2004；张志鹏等，2005；严晋跃等，2009）。尤其是近年 来，随着国家禁止以玉米、小麦等粮食能源作物的乙醇生产，以甘 蔗、甜菜等非粮能源作物的乙醇生产发展迅速。而在众多的非粮能 源作物中，甜高粱具有种质资源丰富、抗逆性强、适应性广、生物 产量高、茎秆含糖量高、乙醇转化效率高，乙醇生产成本低等优点， 被认为是最具发展潜力的能源作物曹文伯，2002；高士杰，2005； 卢庆善，2008）。高粱被认为是植物组织培养困难的
3、植物之一，经 过几十年的发展，虽然取得了很大的进步，但仍落后于水稻、小麦、 玉米等单子叶作物。甜高粱的组织培养研究起步晚，研究的也少， 相关研究报道也很少。.2 水稻研究概况水稻是世界上最重要粮食作物之一，在全球温带、热带、亚热带 和寒带都可种植，在全球的种植面积超过 16346 万公顷，产量超过 1772 万吨，占全球作物总产量的 24.38%FAO，2012）。水稻已经 成为单子叶植物研究的模式植物，其遗传转化在品种改良、基因功 能检测和突变体筛选中的作用日益凸显。随着大规模的水稻基因组 测序的结束和水稻序列图谱的绘制，基因组数据库中积累了大量的 数据，功能基因组的研究已经被提上议事日程。
4、因此，如何建立一 套稳定、高效的转化系统就显得非常重要。经过科学家们半个多世纪的不断努力，水稻的高效遗传转化系统已经建立，农杆菌介导的 遗传转化技术也日益成熟。水稻的组织培养始于 1955 年 Fujiwara 等进行的水稻根尖培养。随后，水稻花药、幼胚、幼穗、成熟胚、 成熟种子等的组织培养研究相继被报道。1968 年，日本科学家 HNiizeki 等进行了水稻花药组织培养研究，并首次获得了水稻花培 植株。1975 年，我国诞生了首个水稻花培品种单丰 1 号，随后黑 龙江省农科院在 1976-1997 年间利用花药培养技术培育出了 6 个 新品种姜健等，2001）。随后，石太渊和陈伟 1995
5、）进行了水稻成 熟培养的离体培养研究。李树华等 1995）、高振宇等 1999）相继进 行了水稻幼胚的离体再生培养研究。Yang 等 1999）进行了水稻成 熟种子的培养研究，建立了 Taipei309 成熟种子的的高效体外再生 体系。进入 21 世纪后，水稻的组织培养研究发展迅速。周元昌等 2000）、姚淼等 2004）进行了水稻的花药培养，并进行了细胞学研 究。范树国等 2000），黄道强等 2001）进行了水稻幼穗的体系培养 研究，并获得了再生植株。近年来，郑文静等 2008）研究了水稻成 熟胚、幼胚、幼穗和花药的离体培养差异性，并分析了后代的变异 情况；张秀香 2012）建立了 3 个
6、粳稻品种的成熟种子体外再生体 系。第二章 材料与方法1 农杆菌介导甜高粱 Bar 基因再生体系建立成熟种子：绿能 2 号和辽甜 3 号成熟种子，绿能 2 号成熟种 子收获自天津农学院静海教学基地，辽甜 3 号成熟种子由辽甜省农 科院育成。幼穗：甜高粱 BJ-285、07-27、M81-E、罗马、考利，种植在天 津农学院东校区作物标本园中，在抽穗期取 5-7 长的幼穗，用 75%的 乙醇擦拭叶鞘，并于 4预处理 12-24h。幼胚：普通高粱忻粱 52 号和甜高粱 BJ-285、BJ-299、07- 27、M81-E、罗马、甜杂 2 号，种植在天津农学院东校区作物标本 园中，在灌浆期取开花后 10
7、-19 天的幼嫩穗子，用 75%的乙醇擦 拭表面，并于 4预处理 1-6 天。受体材料：忻粱 52 号幼胚、幼胚愈伤组织及 M81-E 幼胚愈伤 组织。菌株：农杆菌 EHA105 菌株。质粒载体：pCAMBIA1301。.2 水稻再生体系建立及 EIS 基因的农杆菌转化取开花授粉后 10-13 天的忻粱 52 号幼嫩种子幼胚约 1-1.5 大小），体外消毒后在超净工作台上分离幼胚，并接种到诱导培养 基上，于 28预培养 2-3 天。收集预培养过的幼胚，加入共培养 培养液 I，于 43水浴锅中保温 3min，倒掉共培养培养液 I，加 入制备好的农杆菌悬液浸染 15min，倒掉菌液，幼胚置于无菌滤
8、纸 上晾 25-30min，然后接种到铺有一层无菌滤纸的 MS 共培养培养 基上，于 28黑暗共培养 2-3 天。愈伤组织则直接用 OD600 值 0.3-0.5 的农杆菌悬液浸染 20min，倒掉菌液，愈伤组织置于无菌滤 纸上晾 35-40min，然后接种到相同的共培养培养基上，相同条件下 共培养 2-3 天。共培养 2-3 天后，幼胚和愈伤组织转接到预筛选 培养基上，在 28黑暗培养 5-7 天，再将其转接到含 500mg/L 头 孢霉素和 20mg/L 潮霉素的筛选培养基上进行筛选。每 2-3 周更换 一次筛选培养基。经 4-5 周的筛选培养，幼胚转化获得的抗性愈伤 先转接到继代培养基上
9、继代 2-3 周，待抗性愈伤组织长到直径约 5 大小再转接到不含抗生素和筛选剂的分化培养基上进行分化培养； 愈伤转化获得的抗性愈伤组织转接到含有 500mg/L 头孢霉素的分 化培养基上进行分化培养，条件为 252每天 16/8h 光照/ 黑暗。第三章 结果与分析201 甜高粱不同外植体愈伤诱导差异分析201.1 不同处理对成熟种子愈伤诱导的影响201.2 不同基因型和不同培养基对幼穗愈伤诱导的影响221.3 不同基因型和不同取材时期对幼胚愈伤诱导的影响.252 甜高粱不同外植体愈伤化差异分析323 甜高粱再生苗生根、移栽与再生植株的获得.384 甜高粱转 Bar 基因研究434.1 潮霉素浓
10、度筛选.434.2 不同受体材料对高粱遗传转化的影响444.3 不同基因型对高粱遗传转化的影响.455 水稻成熟种子再生的影响因素466 水稻再生苗的生根、移栽与再生植株获得507 EIS 基因转化载体的构建与鉴定518 农杆菌介导水稻转 EIS 基因研究.549 水稻 T0 代转基因植株 PCR 检测.56第四章 讨论.581 褐变对甜高粱植株再生的影响582 外植体类型对甜高粱植株再生的影响583 基因型对甜高粱植株再生的影响.594 不同培养条件对水稻成熟种子植株再生的影响595 影响高粱转化率的因素60第五章 结论61第四章 讨论1 褐变对甜高粱植株再生的影响褐变在植物组织培养中普遍存
11、在，在高粱组织培养中比较严重。 褐变可分为酶促褐变和非酶促褐变。大多数褐变被认为是酶促褐变， 其发生机理是在有氧条件下，多酚类物质被多酚氧化酶(PPO)氧化成 醌，再经一系列的脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质，从而引 起褐变颜昌敏，1990）。引起酶促褐变的底物主要是酚类物质，如 咖啡酸、单宁、木质素等崔堂兵等，2001）。高粱在组织培养中易 发生褐变主要是因为含有单宁，且单宁含量越高，褐变越严重。本 研究中，高粱成熟种子、幼穗和幼胚的组织培养都发生了褐化，只 是褐化的程度不同。在成熟种子培养中，辽甜 3 号愈伤组织在分化 过程中分泌黄褐色物质，使培养基变黄，分化率很低。在幼穗培养 中，BJ
12、-285、罗马和考利在诱导和分化过程中分泌褐色物质，使培 养基发生不同程度褐化，诱导率较低，BJ-285 的分化率也很低，罗 马和考利则未能分化出苗；07-27 和 M81-E 在诱导过程中不分泌 褐色物质，诱导率较高，但在分化过程中分泌褐色物质，07-27 的 分化率不高，M81-E 则未能分化出苗。结论通过对 2 个甜高粱品种成熟种子、5 个甜高粱品种幼穗、6 个甜高粱品种幼胚及 1 个普通高粱品种幼胚进行组织培养研究，建立 了适合本实验室的甜高粱体外再生体系，并进行了 bar 基因的遗传 转化研究，获得了一株转基因苗。主要研究结论如下：1. 在成熟种子愈伤诱导中，不同基因型不同基本培养基
13、和不同 激素配比处理对愈伤诱导有极显著影响；在愈伤分化过程中，不同 培养基和不同基因型均对愈伤分化有显著影响。结果表明：辽甜 3 号的诱导率为 56.34%，分化率为 2.78%，绿能 2 号的诱导率为 58.79%，分化率为 0；辽甜 3 号的最适诱导培养基为 MB 基本培 养基+2,4-D2.0mg/L，绿能 2 号的最适诱导诱导培养基为 MS 基本 培养基+2,4-D3.0mg/L+KT 0.3mg/L；低浓度 2,4-D 和 KT 配合使用 的诱导效果优于低浓度 2,4-D 单独使用优于高浓度 2,4-D 和 KT 配合使用。2. 在幼穗愈伤诱导中，基因型对愈伤诱导有显著影响，而培养 基及基因型和培养基互作对愈伤诱导的影响不显著；在愈伤分化中， 基因型和培养基对愈伤分化有显著影响。结果表明：M81-E 的诱导 效果最好，优于 07-27 优于 BJ-285 优于考利优于罗马；07-27 的 分化效果最好，获得了 35 棵再生苗，分化率为 13.13%，其次是 BJ-285，获得了 1 株再生，分化率为 1.3%，罗马、考利和 M81-E 则未能分化出苗，分化率为 0；R3 的分化效果较优于 R4 优于 R5。
