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1、1,第七章 酶工程制药,2,3,4,第一节 概述,一、酶工程简介（Enzyme Engineering）酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。,5,酶工程的名称出现在20世纪20年代，主要指自然酶制剂在工业上的规模应用。 1953年，德国人提出了酶固定化技术 。 1969年，日本人用固定化技术拆分了DL-氨基酸。 1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的主要内容：酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定化酶的应用。,6,一 、酶的基础知识,（一）酶是生
2、物催化剂 酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。 催化高效性 专一性：结构专一性；立体异构专一性 酶具有不稳定性,7,（二）酶的化学本质 蛋白质,酶,单纯酶,结合酶,（全酶）= 酶蛋白 + 辅因子,辅因子,辅酶,与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。,辅基,与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。,金属激活剂,金属离子作为辅助因子。,8,必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。,活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。,必需基团,活性部位,维持酶的空间结构,结合基团,催化基团,专一性,催化性质,9,二、现代酶工程的主要内容：,1.酶的分离纯化、大批量生产
3、及新酶和酶的应用开发； 2.酶和细胞的固定化及酶反应器的研究，包括酶传感器、反应检测； 3.酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究； 4.酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究；,10,5.有机相中酶反应的研究； 6.酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究； 7.抗体酶、核酸酶的研究； 8.模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。,11,三、酶的来源,酶的来源：酶的生产目前多数直接从生物体中提取分离。非常少的是合成,基因工程. 早期酶的生产多以动植物为主要原料，如激肽释放酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶。近10年来，研究发展了动植物组织培养技术，但周期长、成本高。工业生产一般都以微生物为主要
4、来源。目前使用的千余种商品酶，大多数是微生物生产的。其特点是：,12,1.微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都年从微生物中得到； 2.微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可通过控制培养条件来提高酶的产量； 3.微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段，能培育出新的高产菌珠。,13,目前常用的产酶微生物,E.coli ：是应用最广泛的产酶菌。分泌胞内酶，经细胞破碎分离得到。在工业上用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、-半乳糖苷酶 枯草杆菌：主要用于生产-淀粉酶、-葡萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶。,14,啤酒酵母：用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包等 曲酶（黑曲酶和黄曲酶）
5、：主要生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶。 其他产酶菌：青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉菌等,15,四、酶在医药领域的应用,1.在疾病诊断方面的应用 由于酶具有专一性强、催化效率高、作用条件温和等显著的催化特点，酶学诊断已经发展成为可靠、简便又快捷的诊断方法，具有广阔的应用前景。 酶学诊断方法包括两个方面，一是根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病，二是利用酶来测定体内某些物质的含量，从而诊断某些疾病。,16,(1)根据体内酶活力的变化诊断疾病: 一般健康人体内所含有的某些酶的量是恒定在某一范围的。当人们患上某些疾病时，则由于组织、细胞受到损伤或者代谢异常而引起体
6、内的某种或某些酶的活力发生相应的变化。故此，可以根据体内某些酶的活力变化情况，而诊断出某些疾病。,17,(2)用酶测定体液中某些物质的变化诊断疾病： 人体在出现某些疾病时，由于代谢异常或者某些组织器官受到损伤，就会引起体内某些物质的量或者存在部位发生变化。通过测定体液中某些物质的变化，可以快速、准确地对疾病进行诊断。酶具有专一性强、催化效率高等特点，可以利用酶来测定体液中某些物质的含量变化，从而诊断某些疾病。,18,2.在疾病治疗方面的应用-酶类制剂 酶可以作为药物治疗多种疾病，用于治疗疾病的酶称为药用酶。药用酶具有疗效显著，副作用小的特点，在疾病的治疗方面的应用越来越广泛,19,消化类：研究
7、最早，是品种最多的一类酶. 在这一类酶中主要有胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、纤维素酶、木瓜酶、凝乳酶、无花果酶、菠萝酶等。,健美生消化酶帮助肠胃蠕动,20,抗炎净创类：目前在治疗上发展最快，用途最广的一种。 多数是蛋白质水解酶，分解发炎部位纤维蛋白的凝结物，消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑。 其中有些酶能够分解脓液中的核蛋白使成简单的嘌呤和嘧啶，降低脓液的粘性、达到净洁创口、消除痴皮、排除脓液抗炎消肿的目的。 主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶，-淀粉酶、胰脱氧核糖核酸酶等。,21,血凝和解凝类：这类酶都是从血液中提取出来的。 凝血酶的作用是促使血中纤维蛋白元变成不溶性纤维蛋白,从而促使血液凝固，防止微
8、血管出血。 纤维蛋白溶解酶的作用是溶解血块，为目前临床上最新的一种酶制品,治疗血栓静脉炎、冠状动脉栓塞等。 抑肽酶作为肽酶抑制剂，广泛应用于体外循环手术，大剂量抑肽酶可明显减少心脏外科手术后的渗血，消除因心脏外科手术后渗血而导致的死亡,22,23,凝血酶,24,解毒类：主要作用是解除体内或因注射某种药物产生的一种有害物质。 主要品种有青霉素酶、过氧化氢酶和组织胺酶等。 青霉素酶能够分解青霉素分子中的一内酰胺环，使变成青霉噻唑酸，消除因注射青霉素引起的过敏反应。,25,3.在药物生产方面的应用 利用酶的催化作用将前体物质转变为药物。这方面的应用日益增多。现已有不少药物包括一些贵重药物都是由酶法生
9、产的,26,27,28,4.在分析检测方面的应用 酶法检测或酶法分析 如：ELISA,免疫组织化学，Western blot中的HRP,29,1、细胞破碎 2、酶的提取 3、酶的分离方法 4、酶的组合分离纯化策略 5、酶的浓缩、干燥与结晶,第二节 酶的分离纯化,30,一、酶的分离纯化技术路线,细胞破碎,酶提取,酶分离纯化,酶浓缩,酶贮存,动物、植物或微生物细胞,发酵液,离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。,31,二、酶的提取,（一） 细胞破碎 许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。 1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）
10、酶解破碎,JY92-II D超声波 细胞粉碎机,细胞破碎珠,高压细胞破碎机,DY89-I型 电动玻璃匀浆机,32,1.采用缓冲体系：防PH大幅度变化而失活 2.添加保护剂：防活性基集团活性中心受影响 3.抑制水解酶的作用 4.其他保护措施：温度，PH，搅拌，光照，氧化等影响,33,（二）酶的抽提,34,(三）沉淀分离,35,三、酶的纯化,过滤与膜分离 电泳 离子交换层析,36,第三节 酶和细胞的固定化,（一）固定化酶的制备 1、固定化酶（immobilized enzyme）的定义:指限制或固定于特定空间位置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催
11、化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。,37,2、固定化酶的特点,（1）可以多次使用，酶的稳定性提高； （2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化。 （3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制； （4）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少； （5）比水溶性酶更适合于多酶反应。,38,39,（1）载体结合法：将酶结合于不溶性载体上的固定化方法。 A.物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的固定化方法。活性碳,多孔玻璃,树脂等 优点：操作简单，可选用不
12、同电荷和不同形状的载体，有可能固定化和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再生。 缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活下降并污染产物。,40,B、离子结合法：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上。DEAE-纤维素等 优点：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏。 缺点：载体和酶的结合力弱，易受缓冲液种类或pH的影响，离子强度高时，酶易脱落。,41,C、共价结合法：酶以共价键结合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。 优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，不
13、易脱落。 缺点：载体要活化，反应条件苛刻，操作复杂，反应条件剧烈，酶易失活和产生空间位阻效应。,42,（2）交联法：用双功能或多功能试剂使酶与酶或细胞与细胞之间交联的方法。交联法又分：交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法和载体交联法。常用的交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。,43,酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶,44,（3）包埋法：,A、网格型：将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中。 常用合成高分子化
14、合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶。多用于固定化细胞,45,B、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要求高，制备成本也高。,46,47,（二）新型的酶固定化方法,温和的条件下进行，减少酶活力损失，提高固定化效率 光偶联法：光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶 等离子体法：高度激发的原子、分子，自由基的聚集体，载体表面用等离子体修饰，引入活性基团,48,无载体固定化酶直接用交联剂交联用交联剂交联溶解酶、晶体酶、物理聚集
15、酶、和喷雾干燥酶等四种无载体酶体系，优点如下：1.催化活性高，成本低2.具备较高的催化剂比表面3.可加入多种酶4. 底物扩散受限制少5.极端条件下稳定性高,49,（三）固定化细胞的方法,1.固定化细胞的定义将细胞限制或定位于特定空间位置的方法. 第二代固定化酶.不用载体，通过化学或物理的手段使细胞彼此附着相连另外还有载体粘合，金属螯合等多种方法,50,2、固定化细胞的制备技术,（1）载体结合法制备技术：将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶活性。缺点：吸附容量小结合强度低。 （2）包埋
16、法制备技术：与包埋酶法相同。,51,（3）交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少用。 （4）无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。 此外还有粘合法，截留法等,52,（四）常用的固定化酶载体材料,1.固定化酶载体材料的性质要求 (1)功能基团 (2)渗透性和比表面：大的比表面和多孔结构 (3)溶解性：要求不溶于水 (4)机械刚性和稳定性： (5)组成和粒径：孔径小 (6)对微生物的抵抗性 (7)经济环保,53,2.固定化酶载体材料 (1)高分子载体 1)天然高分子材料： 优点：无毒，传质性好 缺点：易被微生物降解 一般用壳聚糖，海藻酸钠,54,1)合成有机高分子材料： 强度大，抗微生物降解 聚苯乙烯,55,(2)无机载体 稳定性好，机械强度高，不易降解，耐酸，成本低，寿命长 玻璃，硅凝胶，铝等,56,（3）复合载体： 无机有机材料复合组成的新型载体 磁性高分子微球:内部含有磁性金属或金属氧化物的超细粉末。 回收简单,
