微生物的营养与生长（三）

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1、微生物的生长,生长与繁殖的概念 生长微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。 繁殖生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。,发育从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。个体生长微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。群体生长群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。（由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况）个体生长个体繁殖 群体生长群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖

2、,在微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养。在微生物学中培养和发酵两个概念是相同。在工业上大规模的进行微生物培养称为微生物发酵。,微生物生长测定,描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需选用不同的测定指标。 （一）微生物细胞数目的检测法 直接法（血球计数板、比例计数法） 间接法（活菌计数法、液体稀释法、膜过滤法） （二）微生物生长量和生理指标测定法 直接法(干重法，堆体积法) 间接法（比浊法，碳、氮含量法，其它生理指标）,一、直接计数法 1、显微计数法（血球计数板法） 原理：将1cm20.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小

3、格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。,适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。,2、比浊法（比色发）原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。特点：快速、简便；但易受干扰。,3、平板菌落计数法 技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15-20min完成

4、操作），严格无菌操作； 注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度； 适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物； 误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作。,4、干重测定法将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105、100或80)、称重。一般干重为湿重的10%20%，而一个细菌细胞一般重约10-1210-13g。该法适合菌浓较高的样品。 如大肠杆菌一个细胞一般重约1012-1013g，液体培养物中细胞浓度达到2109个/ml时，100ml培养物可得10-90mg干重的

5、细胞。,5、菌丝长度测定法 该法适用于对丝状真菌生长长度的测定。 方法：将真菌接种在固体培养基的平皿中央，定时测定菌落的直径或面积，直到菌落覆盖整个平皿。 缺点：不能反映菌丝的纵向生长，不能计算菌落的厚度和培养集中的菌丝。接种量也能影响结果，不能反映菌丝的总量。 也可用U型管培养法，该法方便不易污染，但通气不良。,6、细胞堆积体积测定法 方法：将细胞悬浮液装入毛细沉淀管内，离心，根据堆积体积计算含菌量。 该法快速、简便，培养液中如有其他固体颗粒，则误差较大。 也可以用有刻度的离心管离心，通过所得的沉淀体积推算出细胞的质量。,7、电子计数器法 方法：在计数器中放有电解质及两个电极，将电极一端放入

6、带微孔的小管，通电抽真空，使含有菌体的电解质从小孔进入管内。当细胞通过小孔时，电阻增大，电阻增大会引起脉冲变化，则每个细胞通过时均被记录下来。因样品的体积已知，故可以计算菌体的浓度，同时菌体的大小与电阻的大小成正比。 该方法方便、快捷，但不能测定含有颗粒的菌液，对链状和丝状菌无效。,9、薄膜过滤计数法常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。,10、涂片染色法 应用：可同时计数不同微生物的菌数，适 于土壤、牛奶中细菌计数。 方法：用镜台测微尺计算出视野面积

7、；取 0.1ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代入公式： 每ml原菌液含菌数= 视野中平均菌数涂布面积/视野面积 100 稀释倍数,二、间接测定法1、测定细胞的组分含量进行估算 （1）测定DNA的含量 （2）测定蛋白质的含量 （3）测定ATP的含量,2、从培养基中的某营养物的消耗来估算3、从菌体代谢产物来估算4、从发酵液的黏度来估算5、从发酵的放热量估算6、从发酵液的酸碱度来估算,测含氮量蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可

8、测得粗蛋白的含量。含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。,微生物的生长规律,由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上的困难。同步生长的概念：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态，称为同步生长，进行同步分裂的细胞称为同步细胞。同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料。,获得同步生长的方法主要有两类：环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细

9、胞代谢。,一、单细胞微生物的群体生长曲线单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌，其群体生长是以群体中细胞数量的增加来表示的，由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代，一个世代所需的时间就是代时，代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需时间，有时也称为倍增时间。单位时间内繁殖的代数成为生长速率。,图中表示的是一个细胞经过若干代分裂后的情况。从图可见，每经过一个代时，细胞数目就增加一倍，呈指数增加，因而被称为指数生长，这就是单细胞群体生长的特征。,以细菌为例介绍单细胞微生物群体生长规律，其结论也基本适用于酵母菌。生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至死亡的整个动态变化过程。每种细菌都有各自的典

10、型生长曲线，但它们的生长过程却有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。,生长曲线：把少量的细菌接种到合适的液体培养基中，在适宜的条件下培养，定时取样测定单位体积的细胞数，并绘制所得的曲线：以细菌细胞数目的对数作纵坐标，以培养时间为横坐标，得出细菌在生长过程中的曲线图。根据生长曲线的变化规律，可分为延迟期、对数生长期、稳定期、衰亡期四个阶段。,微生物生长曲线是用以描述微生物在一定环境中进行生长、繁殖和死亡的规律。微生物生长曲线既可作为生长状态的研究指数，又可作为控制发酵生产的理论依据。,微生物的生长规律,延滞期 对数生长期 稳定期 衰亡期单细胞微生物的典型生长曲线,细 胞 数目的对数

11、,微生物的生长曲线,将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。,1、延迟期是微生物细胞进入新环境的适应时期，也是细胞调整其大分子和小分子物质的组成（包括酶和细胞结构成分）又称为调整期。微生物延迟期的长短以细菌、酵母较短，霉菌次之，放线菌最长。其它名称：停滞期、调整期、适应期。,现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。特点：生长速率常数= 0；细胞形态变大或增长；细胞内RNA特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强；合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱

12、导酶；对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素、化学药物、辐射等）原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物。,影响延滞期长短的因素菌种 ：繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短。接种物菌龄 ：用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期。接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用1/10的接种量）。培养基成分：在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。,对实践的指导意义：在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期；采取的缩短

13、延迟期的措施有： 增加接种量； （群体优势-适应性增强） 采用对数生长期的健壮菌种； 调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养基的某些成分。 选用繁殖快的菌种 在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌,2、对数生长期代时以G表示，生长速率以R表示，设t1时刻的菌数为N1，经过n次分裂后，t2时刻的菌数为N2,例如：一培养液中微生物数目由开始的12000（B），经4h（t）后增加到49000000（b），这样，n(lg4.9107lg1.2104）0.30112借助于n和t，还可以计算出不同培养条件下的代时G，Gt/n在本例中，G460/1220min 该种微生物的代时为20分钟。在4小时内共繁殖

14、了12代。,代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长速率快，代时长，生长速率慢。在很多微生物学研究中常常要了解微生物的代时。代时在不同种微生物中的变化很大，多数微生物的代时为1-3h,然而有些快速生长的微生物的代时还不到10min,而另一些微生物的代时却可长达几小时或几天；另外，同一种微生物，在不同的生长条件下其代时的长短也不同；但是，在一定条件下，每一种微生物的代时是恒定的，因此它是微生物菌种的一个重要特征。,一些细菌的代时,菌名 培养基 培养温度 代时 E. coli（大肠杆菌） 肉汤 37 17min E. coli 牛奶 37 12.5 Enterobacter aerogenes（产

15、气肠细菌） 肉汤或牛奶 37 16-18 E. aerogenes 组合 37 29-44 B. Cereus（蜡状芽孢杆菌） 肉汤 30 18 B. thermophilus（嗜热芽孢杆菌） 肉汤 55 18.3 Lactobacillus acidophilus（嗜酸乳杆菌） 牛奶 37 66-87 Streptococcus lactis（乳酸链球菌） 牛奶 37 26 S. lactis 乳糖肉汤 37 48 Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌） 肉汤 37 23.5 Azotobacter chroococcum（褐球固氮菌） 葡萄糖 25 344-46 Mycobacterium tuberculosis（结核分枝杆菌）组合 37 792-93 Nitrobacter agilis（活跃硝化杆菌） 组合 27 1200,不同温度下的代时温度对微生物的代时有明显影响：E. Coli 在不同温度下的代时 温度（）代时（分）温度（）代时（分）10 860 35 2215 120 37 1720 90 40 17.525 40 45 2030 29 47.5 77,