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1、 两个二倍体棉种 CDPK 和 FAD 基因家族的 全基因组鉴定与基因结构功能分析 第一章文献综述1.1 棉花综述棉花是我国农产品中最大的经济作物。棉纤维属于可再生的天然 纤维，是世界上天然纺织纤维最重要的来源。由于棉籽中含有丰富 的脂肪和蛋白质，被广泛用于食用油、工业用油和动物飼料等。此 外，棉花在国防、医药等领域也有重要的用途。我国是世界上棉花 生产大国，同时也是棉花消费大国，棉纤维是人们衣着的主要原料， 从消费比例看，虽然化纤产品替代棉纺织品的比例有一定上升，但 是棉衣棉布作为衣着的主体难以动摇。目前，我国已经形成长江流 域、黄河流域和西北内陆三大优势棉区。2013 年，全国棉花种植面
2、积 435 万 hm2,产量 631 万 t，种植面积和产量分别占世界总量的 14%和 28%，其中产量居世界首位。近年来，由于种植棉花投入大和比较 效益低，长江流域和黄河流域棉区植棉面积面临着持续萎缩，棉花 种植区域迫切需要进行适应性布局调整。新疆是我国最大的棉花生 产基地，是我国棉花生产的优势地区，因此稳定和发展新疆棉区是 保障国家棉花安全的主体。棉花是一种耐盐械抗旱作物，开发利用 华北和西北地区部分闲置盐碱地旱地，促进棉区转移，开拓植棉新 区域，是保障棉花生产安全的另一战略陈萌山，2014)。1.2 低温胁迫的研究进展植物在生长发育过程中会受到许多外界非生物和生物因素的影响， 例如低温、
3、干旱、高盐和病虫害等 Xiong et al., 2002)。很多楦物， 比如水稻、玉米、大豆、番东和棉花等，对低温都比较敏感，而且 低温适应能力差，低温胁迫是限制它们生长的最重要环境因素之一 Barrero-Gil and Salinas, 2013; Chirmusamy et al.,2007; Lissarre et al., 2010)。低温胁迫根据其程度不同可以划分为两类：冷害(Chilling stress)和冻害 Freezing stress) (Chinnusamy et al., 2007)。冷署是指 20 C 以下的低温对植物造成的伤害。冻害是指 0 -C 以下的低温
4、使植物体内结冰，造成植物组织损伤。低温对植物造成的伤害主要 表现在植物膜系统损伤，物质代谢失调，蛋白质变性，光合作用能 力下降，根吸收能力下降和生长发育受到抑制等。低温胁迫作用的 首要部位是细胞膜系统，而低温胁迫对膜系统不可逆伤害的原初反应发生在生物膜类脂分子的相变上 Lyons，1973)。此外，在低温胁 迫下，植物细胞膜的透性增加，细胞内大量可溶性物质外渗，最后 引发植物代谢失调王宝山，2004)。而且当温度继续下降或持续低温 时，结合在膜上的酶系统就会受到破坏，原有的协调代谢过程不能 正常进行，例如活性氧、自由基产生明显增加，而清除量下降，造 成自由基积累和膜脂过氧化，引起植物中毒苏维埃
5、，1998)。同时低 温还会引发许多晦发生构象的可逆变化，使其内部疏水基和疏水链 外露，导致酶活性减弱甚至丧失，蛋白质变性 Guy etal., 1998;王毅 等，1994)。植物受到低温危害后，体内叶绿素也被破坏，光合作用 能力下降，尤其是起源于热带和亚热带的冷害敏感植物，由于长期 处于温度较高的环境下，温度低于 12 C 就会出现明显的光抑 制现象 Lyons, 1973)。而且研究表明将低温下生长的植株恢复到适宜 条件后仍会表现出持续光合能力下降状态 Haldimann, 1996;刘鹏等， 2002)。低温还会引起根系生长缓慢，吸收面积减少，细胞原生质點 性增加，流动性减慢，呼吸作用
6、减弱使得供能不足，导致植物对矿 质元素的吸收与分配受到限制喻方圆等，2003)。因此低温胁迫处理 的植株与正常生长条件下的植株相比，株型明显变小，生长发育受 到显著抑制潘瑞炽等，1995)。第二章雷蒙德氏棉 CDPK 基因家族的鉴定和基因结构功能分析2.1 材料与方法雷蒙德氏棉基因组数据 Paterson et al, 2012 )从 Phytozome 数据库 中下载。已报道的拟南齐 Hrabak et al., 2003)和水稻 Ray etal., 2007) CDPK 基因附表 1)的蛋白质序列分别从 TAIR 和 RGAP ( RGAP release 7, 利用 ClustalX2
7、 软件 Larkin et al., 2007)对所有 CDPK 全长 蛋白质序列进行多序列联配，参数为默认值。然后使用 MEGA5.2 软件 TamuraetaL, 2011)中的邻位相接法 neighbor-joining, NJ)对联配 结果构建系统进化树，并选择成对删除空位的选项，采用 bootstrap 法对进化树进行评估，重复值设为 1000。通过比较每个基因对应的 基因组序列和其预测的编码区序列，利用 GeneStructure Display Server 在线工具(Hu et al.,2015)分析每个基因的内含子-外显子结构。 结合雷蒙德氏棉基因组数据注释文件，将所有 CD
8、PK 基因定位在雷 蒙德氏棉的染色体上，染色体足位图通过 Maplnspect 软件绘制 Liu et al., 2014)。判定基因复制事件的条件：1)两个基因序列相互匹配部 分的长度大于较长序列长度的 80%; (2)两个基因序列相互匹配部分的相似性大于 80%; (3)紧密相连的基因中，只参与一次复制事件 Jiang et al., 2013; Kong et al.，2013; Yanget al.，2008)。进一步结合 CDPK 基因在染色体上的位置，判断是串联复制还是片段复制。.2.2 结果与分析本研究以拟南齐和水稻的 CDPK 基因的蛋白序列作为查询序列， 在构建的雷蒙德氏棉基
9、因组本地数据库中进行 BlastP 和 tBlastN 检 索，初步获得的候选序列提交到 Pfam 和 SMART 数据库中进行验证， 最终在雷蒙德氏棉基因组中鉴定出 41 个 CDPK 基因家族成员表 2.2)。 参考已报道的拟南界 CDPK 命名原则(Hrabak et al.，1996)，将雷蒙 德氏棉 41 个 CDPK 基因命名为 GrCPKl?GrCPK41。数字的排列根据 这些基因在染色体上的位置，从第 1 条染色体到第 13 条染色体，每 条染色体从上到下。通过分析从 NCBI Sequence Read Archive (SUA) 数据库中下载的转录组数据发现，本研究鉴定的
10、41 个 CDPK 基因 中，至少 37 个在雷蒙德氏棉中存在表达信息图 2.1)，说明至少 37 个 CDPK 基因是功能基因。雷蒙德氏棉中鉴定出的 CDPK 基因总数 比拟南多了 7 个，比水稻多了 10 个。同时根据预测的蛋白序列， 本研究推测了雷蒙德氏棉 41 个 CDPK 蛋白质的长度、分子量和等 电点。其中，雷蒙德氏棉 CDPK 基因所编码的蛋白质含有的教基酸 数目最多 873 个，最少 487 个；分子量最高迖到了 97.10 kDa，最 低 54.63 kDa;等电点分布在 5.06?9.08 之间。这些理化性质与其它植 物中的 CDPK 基因相比是相近的 Hrabak et
11、al., 2003; Ma et al., 2013; Ray et al., 2007; Zuo et al., 2013 )。第三章亚洲棉 CDPK 基因家族的鉴定.393.1 材料与方法.403.2 结果与分析.423.3 讨论.563.4 小结.59第四章雷蒙德氏棉膜结合 FAD 基因家族.604.1 材料与方法.604.2 结果与分析.624.3 讨论.654.4 小结.69第五章亚洲棉膜结合 FAD 基因家族的鉴定.775.1 材料与方法.775.2 结果与分析.805.3 讨论.825.4 小结.89第五章亚洲棉膜结合 FAD 基因家族的鉴定与基因结构功能分析脂肪酸晚氢酶 FAD
12、)是不饱和脂肪酸合成途径的关键酶，分为可 溶性脂肪酸脱氧赌和膜结合脂肪酸脱氧酶，两种酶之间无进化关系 L6pez Alonso et al.,2003 ； Sperling et al., 2003 )。目前只有植物的 硬脂酰-ACP 脱氢酶是已知的唯一可溶性脱复酶家族 Yukawa etal.，1996)，而膜结合脂肪酸脱复赌普遍存在于真核生物和细菌中 Hashimoto et al., 2008; Sperling et al, 2003)。第四章已经对雷蒙德氏 棉膜结合 FAD 基因进行了全基因组分析，发现膜结合 FAD 基因在 雷蒙德氏棉中发生了物种的特异性扩增，不同组织的表达模式分析
13、 发现多个 FAD 基因在胚珠中特异性表迗，而低温胁迫下的表达分析 发现膜结合 FAD 基因确实参与了棉株低温胁迫下的应答反应。本研 究在亚洲棉全基因组测序完成的基础上对 A 基因组亚洲棉中的膜结 合 FAD 基因家族进行了鉴定，同时结合第四章的研究结果，对膜结 合 FAD 基因家族在 D 基因组和 A 基因组中进行了全基因组水平的 综合比较分析，包括膜结合 FAD 基因在两个基因组中的染色体定位、 基因结构、蛋白质结构以及表迗模式等进行了全面比较分析，这些 结果将为探究膜结合 FAD 基因家族在棉属植物中的进化奠定基础。.结论本研究在二倍体棉种 D 基因组雷蒙德氏棉和 A 基因组亚洲棉全 基
14、因组测序完成的基础上，对棉花低温胁迫相关的两个基因家族 CDPK (耗依赖蛋白激醇）和膜结合 FAD (膜结合脂肪酸脱氧酶）在 全基因组水平上进行了鉴定和基因结构功能分析。本研究利用先公 布的 D 基因组雷蒙德氏棉基因组数据，对棉花 CDPK 基因进行了全 基因组分析。在雷蒙德氏棉基因组中鉴定出 41 个 CDPK 基因，分散分布在雷蒙德氏棉 13 条染色体上，进化分析将它们分为四个不同 的亚家族。片段复制导致雷蒙德氏棉中 CDPK 基因的物种特异性扩 增，而且基因发生复制后功能分化受到严格限制。表达模式分析表 明 CDPK 基因参与棉花对低温胁迫的响应反应。进一步结合后来公 布的亚洲棉基因组数据，对亚洲棉和雷蒙德氏棉基因组中的 CDPK 基因进行了综合比较分析，发现亚洲棉基因组比雷蒙德氏棉基因组 多 2 个 CDPK 基因,亚洲棉其余 41 个 CDPK 基因与雷蒙德氏棉 41 个 CDPK 基因存在对应的直系同源关系，而且它们 的基因结构和蛋白质结构都非常保守，但是大部分直系同源基因在 不同组织以及低温诱导下的表达摸式存在一定差异，表明它们在功 能已经开始分化，推测这可能与雷蒙德氏棉和亚洲棉经过物种特异 的进化后需要适应不同的生存环境有关。这些结果将为进一步研究 棉属植物低温胁迫下的响应机制及揭示棉属植物中 CDPK 基因的进 化关系提供重要的数据支持。
