第十六章色谱分析法概论

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1、第十六章 色 谱 分 析 法 概 论,概述 色谱法是一种重要的分离、分析技术。 一、色谱法（起源）,1906年，俄国植物学家茨维特（Tswett）首次研究了植物叶的色素成分。（如图）分析过程为离线的，即不能连续进行。人们将这种方法称为色谱法，随着色谱法的发展，可对大量无色物质进行分离，但仍沿用了色谱法这一名词。,利用各组分物理化学性质的不同，在 流动相流经固定相时，由于各组分在两相 间的吸附、分配或其它亲和力的差异而产 生不同速度的移动，最终达到分离的目的。,分离基础:,差 速 迁 移,现代色谱法 的分离、分析 过 程是在线 的，即连续进 行。,分离功能为主；定性鉴别专属性好，定量 分析准确灵

2、敏快速。,可分离组分性质相似混合物,可分离分析存在干扰组分的复杂体系,二、色谱法特点 分离效率高 选择性好 集分离、分析于一体 灵敏度高（可测10-1110-13g） 分析速度快 易与其它仪器联用，应用范围广,第一节 色谱法的分类和发展,一、色谱法的分类 1.按两相（固定相与流动相）状态分类气相色谱法色谱法 液相色谱法超临界色谱法,2.按分离原理分类吸附色谱分配色谱 色谱法 离子交换色谱凝胶色谱（扩散）、 亲和色谱、络合色谱、热色谱等,3.按固定相形式分类填充柱色谱柱色谱 色谱法 毛细管色谱纸层色谱薄层色谱,柱色谱( column chromatography ): HPLC， GC etc.

3、,平板色谱 ( planar chromatography ): TLC， PC,二、色谱法的发展,色谱法的历史,色谱法的现状和发展趋势1.新型固定相和检测器的研制2.色谱新方法的研究3.色谱联用技术4.色谱专家系统,第二节 色谱过程和基本原理,一、色谱过程及色谱图,物质分子在相对运动的两相间，分配“平衡”的过程。分离机制是差速迁移。,二、色谱流出曲线和有关概念,色谱流出曲线,1.色谱流出曲线,当试样流经色谱柱后，各组分随流动相的移动而在两相间反复进行吸附、解吸、或分配、萃取过程，最后依次得到各组分，将各组分浓度经检测器转换成电信号而记录下来，得到一条信号随时间变化的曲线，称为色谱流出曲线。,

4、2.基线操作条件稳定后，仅有流动相通过时，检 测器响应讯号随时间变化的曲线。3.色谱峰（P339) 4.色谱峰区域宽度它是组分在色谱柱中谱带扩张的函数，可反 映出色谱柱的分离效能,度量色谱峰区域宽度常用三种方法：,标准差 即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。 半峰宽W1/2 即峰高一半处对应的峰宽W1/2=2.354 峰底宽Wb 即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距Wb=4,保留值保留值是试样各组分在色谱柱中保留行 为的量度，可反映出组分与固定相间作用力 大小。 1.死时间t0 不被固定相吸附或溶解的组分，即非滞 留组分（如空气、甲烷）从进样开始到出现 其色谱峰最大值所需的时间。它也是气体流

5、 经色谱柱中空隙所需时间。,2.保留时间tR 某组分从进样到出现色谱峰最大值的时 间。它取决于色谱过程的热力学因素，是定 性依据。 3.调整保留时间tR 扣除死时间后的保留时间。它反映了组分与固定相作用所消耗的时 间，是各组分产生差速迁移的物化基础。,4.死体积 V0 指在t0这段时间内通过色谱柱的载气体 积。即色谱柱内载气所占的体积。V0 =t0 Fc ( Fc，ml/min为流动相流速),注意：死体积大，色谱峰扩张，柱效降低。,6.调整保留体积 VR 指扣除死体积后的保留体积。VR= VR- V0 = tR Fc,保留体积恒定值与载气流速无关,5.保留体积VR 指从进样到出现某组分色谱峰最

6、大值时所通过的载气体积。VR =tR Fc,相对保留值仅与柱温、固定相性质有关。可用 来表示色谱柱的选择性。 * r2，1 ，两组分越易实现分离。 * r2，1 =1时，两组分色谱峰重叠。,7. 相对保留值r2，1,指在相同操作条件下，某组分2的调整保 留值与另一组分1的调整保留值之比。即,V0 和 Vm、t0 和 tm 的区别：,由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间体积称为V0 ，固定相充满死体积所需的时间为t0 。平衡时流动相在色谱柱中占有的体积用Vm表示，经过色谱柱所需时间用tm 表示。 物理意义有区别： Vm V0，tm t0 。 在多数情况下，可忽略导管和检测器内腔容积，视为

7、近似相等。,8.保留指数 I,指将待测物的保留行为换算成相当于正 构烷烃的保留行为(已知范围内组分的定性 参数)。,Ix ：待测组分的保留指数，z与z+n为一对正构 烷烃的含C数，tR(X) 应介于tR(Z)和 tR(Z+n)之间。,色谱峰高和峰面积1.峰高h是组分在柱后出现浓度极大时的检测 信号，即色谱峰顶至基线的距离。2.峰面积A色谱曲线与基线间包围的面积。,分离度（分辨率）R,柱效能和选择性对分离的影响,柱效 选择性差 差差 好 好 好,因此，单独用柱效或选择性不能真实反 映组分在色谱柱中的分离情况，需引入一个 综合指标分离度R分离度：相邻两组分色谱峰保留值之差与 两组分色谱峰峰底宽度平

8、均值之比。即,理论证明，若相邻两色谱峰对称且满足 正态分布， 当 R1 两峰部分重叠R=1.0 分离程度可达98%R=1.5 分离程度可达99.7%通常，R=1.5作为相邻两峰完全分离的 标志。,R = 1.0 基本分离,R = 1.5 完全分离,分离度（resolution， Rs ),色谱从流出曲线中，可得到重要信息： 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少数目； 根据色谱峰的保留值，可以定性分析； 根据色谱峰的面积和峰高，可以定量分析 色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据； 色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。,三、分配系数与色谱分离

9、,分配系数和保留因子1.分配系数K,式中 cs、cm分别为组分在固定相和流动相中的浓度。,K与温度、压力有关；也与组分性质、流动相、固定相性质有关。条件一定时，K一定。,2.保留因子k（分配比、容量因子）,式中 mS、mm分别为组分在 固定相和流动相中物质的质量。,保留因子不仅与温度和压力有关，而且还与固定相和流动相的体积比有关。,3.分配系数和容量因子的关系,分配系数和保留因子与保留时间的关系,意义：在色谱图上找出tR、t0，则可计 算出k，即可以直接从色谱图上求得保留因 子k。反之，分配系数不同的组分具有不同 的保留值，因而在色谱图上有不同位置的色 谱峰。,见P343,色谱分离的前提由上式

10、可见，若使tR0,必须KA KB, 即分配系数不等是分离的前提。,例：某色谱柱的Vs=1.3mL、V0=2.1mL，分离 A、B两物质 KA=10.0、KB=40.0。试计算A、B 的保留体积。,解：设V0=Vm，则VR=V0(1+KVs/Vm)可得：VR(A)=15.1 mL VR(B) =54.1 mL,例：一个气相色谱柱，由固定液的涂量及固定液在柱温下的密度计算得Vs=14.1mL ，载气流速为43.75mL/min。分离一个含A、B、C三组分的样品，测得组分保留时间组分A为1.41min、组分B为2.67min、组分C为4.18min、空气为 0.24min。试计算：(1) 死体积（假

11、定检测器及柱接头等体积可忽略）(2) 各组分的调整保留时间和分配系数(3) 相邻组分的分配系数比,解：,相邻峰分配系数比为：,四、等温线,在一定条件下，组分在固定相和流动相间分配达到平衡时，在两相中的浓度Cs和Cm的比值K为常数，由此绘制出的Cs和Cm的关系曲线显然应为一条直线，被称为等温线。,线性等温线为正常峰凸形等温线，产生拖尾峰；凹形等温线，产生前延峰, 线性等温线 a（理想）对称峰 非线性等温线凸形 b 拖尾峰凹形 c 前沿峰,等温线对各种类型的色谱有指导意义,色谱峰的对称性：,一般使用对称性因子(symmetry factor ) ，计算式为：,完全对称 (B=A) 峰的对称因子为1

12、.00 。 对称因子为0.951.05之间的峰看成为正常峰 (对称); BA: T大于1.05的为拖尾峰。,第三节 基本类型色谱方法及其分离机制,早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固 定相，现多为化学键合固定相，即用化学反应 的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。,分配色谱示意图 流动相(m)中的溶质分子 溶解在固定液(s)中的分子,一、分配色谱（液-液分配色谱）,1.正相分配色谱：流动相极性固定相极性2.反相分配色谱：流动相极性固定相极性洗脱顺序由组分在固定相或流动相中溶解度的相对大小而决定。,二、吸附色谱法（液-固吸附色谱）,以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等； 流动相可以是各种不

13、同极性的一元或多元溶剂。,三、离子交换色谱,固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或 无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上 的交换基团的交换能力的不同而得到分离。,四、空间排阻色谱（凝胶色谱）,以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、 具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的统 称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多 孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。,凝胶色谱示意图 Ge - 凝胶 m - 流动相,第四节 色谱法基本原理,一、塔板理论（半经验理论）（P351）,最早由Martin等人提出，把 色谱柱比作一个精馏塔沿用精馏塔中塔板的概念来 描述组分在两相间的分配行为引入理论塔板数 ( n ) 作为衡

14、 量柱效率的指标,塔板理论将色谱柱假想为一个精馏塔。 即色谱柱（柱长L）是由一系列连续的、相等 的水平塔板组成，每一块塔板高度为H，在每 一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平 衡，然后随流动相按一个一个塔板的方向向 前移动。,塔板理论的基本假设为：,色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律，并很快达到分配平衡。,样品加在第0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。, 流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一 个塔板体积,在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。,虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱 过程是一个动态过程，很难达到分配平衡；组 分沿色谱柱轴方向的

15、扩散是不可避免的。但是 塔板理论导出了色谱流出曲线方程，成功地解 释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能 够评价色谱柱柱效。,塔板理论术语,理论塔板数 n 组分流过色谱柱时，在两相 间进行平衡分配的总次数,(2) 理论塔板高度 H 为使组分在柱内两相间达 到一次分配平衡所需要的柱长,结论：色谱峰 W 越小，n 就越大，而 H 就越小， 柱效越高，n 和 H 是描述柱效的指标,讨论：nL，n1/H(1)L 一定，n，柱效，分离能力(2)一定，n，但柱压和分析时间,n的影响因素： 柱本身的性质； 溶剂系统； 测定组分,有效理论塔板数、有效理论塔板高度,由于死时间t0包括在tR中，而实际的t0不参

16、与柱 内分配，所计算的n值大，H 小，但与实际柱效能 不同；因此常把t0 扣除，采用有效理论塔板数 n有效和有效塔板高H有效评价柱效。,例：已知气相色谱柱长2.0m，固定相为80100目白色硅藻土 上涂渍的5%OV-17，柱温125， 载气(N2)流速30mL/min，记录纸速为2.0cm/min。测得萘的保留时间为2.35min，半峰宽为0.20cm。求理论塔板数和板高。若用甲烷测得死时间为0.20 min， 求有效理论塔板数和板高。,塔板理论的特点, 当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大 (塔板高度 H 越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。 不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。,