食品检验技术(微生物部分)

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1、1 食 品 检 验 技 术- 微 生 物 部 分一、食品中的微生物及其检验（一） 、食品中细菌总数检验的意义1、细菌总数：通常指1g或 1mL或 1cm 2表面积食品检样，经过技术处理，在一定条件下做细菌培养后，所得的细菌菌落总数。eg：肉类沙门氏菌；海产品副溶血性弧菌；冰箱食物嗜冷菌2、食品微生物检验的意义1 ） 、是衡量食品卫生质量的重要指标，也是判定被检食品能否食用的科学依据；2 ） 、可以判断食品加工环境的卫生情况，为食品安全监管提供科学依据，可以有效的防止或减少食物中毒和人畜共患病的发生；3 ） 、保证产品的质量，避免不必要的损失。（二） 、食品中大肠菌群检验的意义1、大肠菌群：是指

2、一群好氧与兼性厌氧，能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌（ 37）2、食品中常见的微生物指标菌落总数、大肠菌群、霉菌及其毒素、致病菌、其他指标3、食品微生物检验范围1 ） 、生产环境的检验； 2)、原辅料的检验；3 ） 、食品加工、储藏、销售储环节的检验； 4 ） 、食品检验。（三） 、灭菌消毒的几种方法1、湿热杀菌（高压蒸汽杀菌）eg：培养基、吸量管、工作服2、干热杀菌（高温干燥灭菌）eg：工作服、口罩3、75% 酒精、消毒水 4、火焰杀菌 5、紫外灯二、培养基（一） 、培养基所需的基准物质1、营养物质（氮源、碳源、无机盐、生长因子、水）；2 2、水； 3 、凝固剂； 4 、抑制剂； 5

3、、指示剂孟加拉红测酵母菌、霉菌大肠杆菌：乳糖胆盐；抑制剂是胆盐类（二） 、培养基的分类1、根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分，可以将培养基分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基2、根据培养基的物理状态来区分，可以分为液体培养基、固体培养基、半固体培养基3、根据培养基的用途来区分，可分为选择培养基、增殖培养基、鉴别培养基（三） 、注意事项1、一般培养法：需氧培养2、培养温度： 25 373、培养基：指示剂应在调节好pH值后再加入；煮溶后要补加足够的水分；不能把培养基煮焦，焦化的不能使用4、灭菌后 pH值会下降 0.1 0.2 ，在做培养基校正pH值时，应比实际值高 0.1 0.2

4、 5、基础培养基保存不能超过两周；生化试验培养基不宜超过一周。（四） 、微生物培养特性观察与记录1、在固体培养基上：观察菌落大小、形态、颜色、光泽度、透明度、质地、隆起形状边缘特征及迁移性等。2、在液体培养中：表面生长情况，浑浊度及沉淀等。3、半固体培养基穿刺接种：观察运动扩散情况。三、染色与细菌的形态观察技术（一） 、影响染色的主要因素1、操作因素：涂片、固定、脱色2、染液因素：新鲜3、细菌因素：不同生长期有所改变（二） 、几种常用的细菌染色法3 1、简单染色法又叫普通染色法，只能用单一染料进行的染色简单染色法的基本程序： 涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检单染色：形态观察，但不能鉴别

5、复染色：两种或两种以上染料2、革兰氏染色法革兰氏染色原理：细菌先经过碱性染料染色，用脱色剂脱色，再复染，若菌体仍保持原来的染料的颜色，就称为阳性；若菌体被脱色，染上复染料的颜色，就称为阴性。（紫色阳性，红色阴性 ）染色流程：涂片 干燥 固定 初染 水洗 媒染 水洗 脱色 水洗 复染 水洗 干燥 观察1） 、制片：取菌一定不要太多，涂片不要太厚，均要无菌操作2） 、初染：用草酸铵结晶紫染色1min后水洗3） 、媒染：滴加碘液媒染1min 后水洗4） 、脱色：滴加 95% 乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止， 大约 20 30s即可水洗5） 、复染：用番红染液复染约1.5min 后水洗6） 、干燥

6、：用吸水纸吸掉水滴，于室温下自然干燥7） 、镜检：注意细胞的颜色并绘出细菌形态图。所需试剂： 草酸铵结晶紫染液、碘液、95% 乙醇、番红染液、石炭酸复红染液注：亦可用 1：10稀释石炭酸复红染液做复染液，复染时仅需10s 3、芽孢染色法芽孢着色、脱色都很难，需采用强染色剂加热染色染色流程：制片 染色 水洗 复染 镜检实验结果： 芽孢呈绿色，菌体呈红色染色试剂： 孔雀绿染色、番红水溶液4、荚膜染色法原理：荚膜是包围在细菌细胞外面的一层黏液性物质，经过染色、脱色后将菌体和荚膜呈现不同颜色。4 染色流程：制片 固定 染色 镜检染色试剂： 纯甲醇、番红液或沙黄染色实验结果： 番红：荚膜无色，细胞红色；

7、沙黄染色：荚膜呈黄色，炭疽芽孢性杆菌呈赤褐色四、食品卫生细菌学检验技术（一） 、检验前的准备1、杀菌：各种玻璃仪器、各种试剂、各类培养基、工作衣、鞋、帽等，灭菌冷却后送无菌室备用。2、做好无菌室或超净工作台的无菌工作，进入后实验没有完成之前不得出入无菌室。（二） 、采样的原则1、代表性； 2、无菌性； 3、完整性；4、清楚性； 5、真实性； 6、严格性；涂抹用 100mL的生理盐水；平时样品用225mL的生理盐水。注：若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质的情况，应从深部提取。（微生物检验不进行复检）（三） 、菌落总数：是指在被检样品的单位质量（g） ，容积（mL ）或表面积（

8、cm 2 ）内，在一定条件下培养后所生成的细菌集落的总数。（单位： CFU ）注：一定条件下是指培养基及其pH 、培养温度与时间、计数方法（每个稀释度两块平板） 37 、48h （四） 、菌落计数与稀释度的选择及菌落数的报告1、菌落计数若片状菌落不到平皿的 1/2 ，而其余 1/2 中菌落分布又很均匀，则可计算1/2个平皿后乘以 2以代表全平皿菌落数。若仅一条链， 则视为一个菌落；若有不同来源的几条链，则视为每一条链为一个菌落。2、稀释度的选择1 ） 、应选取平均菌落数在 30 300之间的稀释度报告 （见表56中例1） 。2 ） 、若有 2个稀释度均在 30 300 之间时，若比值小于或等于

9、2时，取其5 平均数；若比值大于 2时，取其较小数字（见表 56中例2和例3） 。3 ） 、若所有稀释度均大于 300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数（见表 56中例4） 。4 ） 、若所有稀释度均小于 30，则取最低稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数（见表 56中例5） 。5 ） 、 若所有稀释度均无菌落生长， 则应按小于 1乘以最低稀释倍数（见表 56中例6） 。6 ） 、若所有稀释度均不在 30 300之间，则应以最接近 300或30的平均菌落数乘以稀释倍数（见表56中例7） 。3、菌落数的报告菌落数在 100以内时，按其实有数报告；大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面

10、的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可以用 10的指数来表示。表56 稀释度的选择及菌落数的报告方式例次稀释液及菌落数 两稀释液之比菌落总数 /（个/g 或 mL ）报告方式 / （个 /g 或 mL ）10-110-210-31 多不可计164 20 - 16400 16000或1.6 10?2 多不可计295 46 1.6 37750 38000或3.8 10?3 多不可计271 60 2.2 27100 27000或2.7 10?4 多不可计560 313 - 313000 310000或3.1 105 5 27 11 5 - 270 270或2.7 1026 0 0

11、0 - 1 10107 多不可计305 12 30500 31000或3.1 10?6 （五） 、食品卫生大肠菌群检验技术1、大肠菌群： 是指一群在 37培养24h 能分解乳糖产酸产气、 需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 （单位： MPN ）2、大肠菌群的生物学特性1） 、形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽孢杆菌2） 、发酵乳糖产酸产气3） 、培养特性：在 EMB 琼脂上的典型菌落：呈深紫黑色或中心深紫色，圆形稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常带有金属光泽。在麦康凯琼脂上的典型菌落： 呈桃红色或中心桃红圆形，扁平，光滑湿润。（六） 、菌落总数与大肠菌群检测方法的比较项 目检测步骤培养基培养条件

12、单位菌落总数检样稀释倒平皿 培养计算报告营养琼脂生理盐水37、48h CFU 大肠菌群检样稀释初发酵 分离证实试验（ 染色和复发酵 ）计算报告乳糖胆盐生理盐水37、24h MPN （七） 、检验注意事项1、从制备样品原液至稀释完毕，全过程不得超过15min。2、对产酸，但未看到气泡的乳糖发酵，考虑气泡产生。3、进行证实试验，最少挑 2个以上的典型菌落或非典型菌落。五、食品中常见病原微生物检验技术（一） 、沙门氏菌检验技术1、沙门氏菌：为革兰氏阴性短杆菌，不产芽孢及荚膜，周生鞭毛，能运动，兼性厌氧。2、检验程序：检样 增菌（ BP 增菌液 ） 分离培养（ BS 选择培养基或 DHL 选择培养基

13、） 生化试验初步鉴定 血清学试验（鉴别沙门氏菌种类 ） 报告3、生物学特性7 1） 、营养特性：需氧或兼性厌氧，最适温度37，pH6.87.8 对营养要求高。在普通培养基上生长良好，37，24h ，能形成菌落中等大小，直径23mm ，圆形或卵形，表面光滑湿润。2） 、抗热性差，在 60经2030min 就可被杀死。4、沙门氏菌检验目前通用的方法分五个步骤：1） 、前增菌；2） 、选择性增菌；3） 、选择性平板分离；4） 、生物化学筛选；5） 、血清学鉴定（二） 、金黄色葡萄球菌检验技术1、生物学特性1） 、无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏阳性菌2） 、培养特性：营养要求高，在普通培养基上生长

14、良好；需氧或兼性厌氧， 最适生长温度 37， 最适生长 pH7.4；有高度的耐盐性，可在10%15%NaCl 肉汤中生长。3） 、生化特性：可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸产气2、操作要点1） 、增菌： 7.5%NaCl 肉汤； 37，24h ，呈均匀浑浊生长。2） 、平板分离：血平板， 37，2448h 3、检验程序检样 稀释 增菌培养（7.5%NaCl 肉汤增菌培养） 分离实验（血平板、 BP 分离） 镜检、血浆凝固酶试验 报告结果注：血浆凝固酶试验是生化试验的一种，也是证实试验的一种。血浆凝固酶试验：区分葡萄球菌是否具有致病性的重要标志。4、检验结果菌落呈金黄色，大而凸起，圆形，不

15、透明，表面光滑，周围有透明溶血圈（B 型） 。在 BP 平板上的菌落特征：圆形，光滑凸起，湿润，直径2 3mm，呈灰色至黑色，边缘色淡，周围为浑浊带，在其外层有一透明带。5、金黄色葡萄球菌污染的控制1） 、防止带菌人群对各种食物的污染；8 2） 、防止金黄色葡萄球菌对奶及其制品的污染；3） 、对肉制品加工厂；4） 、防止金黄色葡萄球菌肠毒素的生成。（三） 、溶血性链球菌的检验1、生物学特性1） 、形态学与染色： 呈球形或卵圆形， 直径 0.5m 1m 链状排列。革兰氏阳性；衰老培养物常呈阴性。无芽孢、无鞭毛、多数无荚膜。2） 、培养特性：多数为需氧或兼性厌氧，少数为微需氧或专性厌氧；对营养要求高，普通培养基不能良好生长；最适温度 37，pH7.47.6；在液体培养基中， 溶血菌株，呈絮状或颗粒状沉淀生长（上清下浊），不溶血菌株，均匀浑浊生长；在血平板上， 形成灰白色， 半透明，表面光滑，有乳光，圆形突起的细小菌落，菌落周围出现溶血环。3） 、生化特性：均分解葡萄糖产酸；可分解蕈糖，不分解山梨醇、菊糖。4） 、抵抗力： 60，30min 即被杀死，对常用消毒剂敏感。2、检验程序液（固）体检样 样品处理 增菌培养 葡萄糖肉浸液肉汤（或区克氏肉汤：在污染严重时使用）36，24h 分离培养（ 血平板、 37，24h；菌落灰白色 ） 分纯培养（ 血平板、