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1、第五章 核酸的发酵生产,核苷酸 Nucleotide 由嘌呤碱或嘧啶碱、核糖或脱氧核糖以及磷酸三种物质组成的化合物。戊糖与碱基合成核苷，核苷与磷酸合成核苷酸，4种核苷酸组成核酸。 根据糖的不同，核苷酸有核糖核苷酸及脱氧核苷酸两类。 根据碱基的不同，又有腺嘌呤核苷酸（腺苷酸，AMP）、鸟嘌呤核苷酸（鸟苷酸，GMP）、胞嘧啶核苷酸（胞苷酸， CMP）、尿嘧啶核苷酸（尿苷酸，UMP）、胸腺嘧啶核苷酸（胸苷酸，TMP）及次黄嘌呤核苷酸（肌苷酸，IMP）等。 许多单核苷酸也具有多种重要的生物学功能，如与能量代谢有关的三磷酸腺苷（ATP）、脱氢辅酶等。某些核苷酸的类似物能干扰核苷酸代谢，可作为抗癌药物。,
2、1 核酸类物质的概述,嘌呤核苷酸的结构,GMP,AMP,IMP,嘧啶核苷酸的结构,1、核酸类物质的生产现状,1868年，Miescher从浓血细胞的细胞核中发现核酸物质。20世纪40年代对核酸分子的结构认识及其在生命活动中的作用有重大突破。 1913年日本小玉新太郎发现干松鱼的鲜味是因含有5-肌苷酸而引起。1960年日本又发现5-鸟苷酸的呈味效果，继而发现呈味核苷酸与谷氨酸钠（味精）并用时，对谷氨酸钠具有强烈的助鲜效果。此后不久，日本对5-肌苷酸和5-鸟苷酸进行工业化生产，80年代年产量已达4000 吨左右。 中国80年代后对核酸制品生产开展研究工作，年产5-肌苷酸和5-鸟苷酸能力为5080吨
3、。目前预计年产量在300吨。,2、核酸类产品的应用,食品添加剂：强化食品风味，对咸、酸、苦、腥味等有消杀作用。 以5-鸟苷酸（GMP)、 5-肌苷酸(IMP) 和5-黄苷酸(XMP)及其二钠 盐为代表。 功能食品添加剂：婴儿乳制品中添加，可增强婴儿的免疫功能，减少婴儿腹泻的发生 。近年来欧美、日本已在婴儿奶粉中添加核苷酸(推荐用量为72mg/L)，这对于提高婴儿免疫力十分有效（人奶与牛奶的区别）。,临床治疗药物：嘌呤类似物8-氮鸟嘌呤和6-巯基嘌呤具有与抗生素类似的功能，可以抑制癌细胞生长；9-D阿拉伯呋喃糖基腺苷聚肌胞用于治疗疱疹；阿糖胞苷、阿糖腺苷可治疗急性白血病，具有抗癌和抗病毒功效。S
4、-腺苷蛋氨酸及其盐类用于治疗帕金森氏症、失眠并具有消炎镇痛作用。 药物中间体：5-AMP可用于制造ATP、环AMP、S-腺苷甲硫氨酸等生化药物产品， 5-CMP用于制造胞二磷胆碱、CTP、阿糖胞苷、聚肌胞等生化药物；5-UMP参与肝脏解毒物质葡萄糖醛酸苷的生化合成，具有重要生理作用，还可制造UTP、聚腺尿、UDP-葡萄糖等药物。 此外，核苷酸在农业上也有良好的应用前景，用核苷酸及其衍生物进行浸种、蘸根及喷雾，可以提高农作物的产量。,3、核酸类产品的生产方法,化学合成法：工艺复杂，设备条件要求高。 核糖核酸（ribonucleic acid,简称RNA）水解法：酶法和化学用糖质原料或亚硫酸制浆废
5、液等制备酵母菌体，从菌体中分离出RNA，水解RNA，得到5-肌苷酸和5-鸟苷酸。制备RNA的原料，以酵母菌最为实用,产朊假丝酵母、酿酒酵母等酵母。工业生产上以 2热食盐水从其菌体中抽提出RNA最为简便。RNA含量为干菌体的10-15。,用化学法水解RNA：若以氢氧化钙作水解剂，则几乎全部水解成核苷，分离所得到的核苷，再用化学法使其磷酸化，可制得5-肌苷酸、5-鸟苷酸。 酶法水解：采用的5-磷酸二酯酶, 在橘青霉和金色链霉菌存在此种酶。培养这些菌株作为酶源。酶解RNA产物为5-腺苷酸、5-鸟苷酸、5-胞苷酸、5-尿苷酸混合物。还需采用米曲霉产生的5-腺苷酸脱氨酶将混合物中的5-腺苷酸脱氨生成5-
6、肌苷酸。,发酵法和化学法相结合的方法：采用微生物发酵方法,生产核苷,再经化学磷酸化，得到5-肌苷酸和5-鸟苷酸。 采用枯草杆菌、产氨短杆菌、短小芽孢杆菌的腺嘌呤营养缺陷型发酵生产肌苷，再用化学法使其磷酸化得到5-肌苷酸。亦可采用对抗菌素有抗性的枯草杆菌突变株发酵生产鸟苷,同样再经化学磷酸化,生成5-鸟苷酸。,直接发酵法：利用微生物发酵直接生产5-肌苷酸、5-黄苷酸。 以葡萄糖为原料发酵生产5-核苷酸，必须解决使所生成的核苷酸透过细胞膜和不使生成的核苷酸分解成核酸碱基和核苷的问题，现根据代谢调控机制选育出的菌株，已解决此问题。采用对锰离子不敏感的产氨短杆菌突变株，直接发酵生产5-肌苷酸，产率达2
7、0g/L。亦可采用产氨短杆菌突变株直接发酵高产 5-黄苷酸，进而再由其他突变株或用酶法进一步将5-黄苷酸转化为5-鸟苷酸。,4、核酸类产品的生产菌种,发酵法生产核酸的产生菌主要有：枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产氨短杆菌及其变异株。,2 核酸类物质的代谢调控机制,核酸发酵是在氨基酸发酵基础上的进一步深化和发展的代谢控制发酵。 生物体内大分子的核酸是由单核苷酸作为原料聚合而成的，因此，生物体必须先合成单核苷酸。,单核苷酸有两条完全不同的合成途径：全合成途径由磷酸戊糖开始；补救途径由培养基中获取。,一、核苷酸的生物合成途径,采用同位素标记法可知嘌呤环上各个元素的来源：,嘌呤环的前体,合成1分子IMP
8、（肌苷酸）需用1分子PRPP（磷酸核糖焦磷酸）1分子Asp（天冬氨酸）1分子Gly（甘氨酸）2分子甲酸1分子CO22分子NH3 共消耗8分子ATP。,1.嘌呤核苷酸的全合成途径（“从无到有”途径）,IMP肌苷酸 SAICAR5-氨基-(N-琥珀基)代氨甲AMP腺苷酸 酰咪唑核苷酸GMP鸟苷酸 AICAR5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷酸XMP黄苷酸 PRPP磷酸核糖焦磷酸SAMP腺苷琥珀酸 PRA5-磷酸核糖胺,（次黄嘌呤核苷一磷酸）,（腺嘌呤核苷一磷酸）,（黄嘌呤核苷一磷酸）,嘌呤核苷酸的全合成途径(1) 5 -IMP的生成（“从无到有”）：,磷酸戊糖途径,四氢叶酸,各种微生物合成IMP的途径是
9、一样的，但从IMP分别生成AMP和GMP的途径不同。,从IMP开始 枯草杆菌以IMP为中心分出两条环形路线，由此AMP与GMP可以互相转换；产氨短杆菌分出的两条路线不是环形，而是单项分枝的， AMP与GMP不能互相转换,合成IMP的价值：进一步合成AMP和GMP,枯草芽孢杆菌嘌呤核苷酸的全合成途径 (2) AMP和GMP的互变,产氨短杆菌的嘌呤核苷酸生物合成途径,2. 嘧啶核苷酸的全合成途径,谷氨酰胺 的酰胺基,3. 核苷酸生物合成的补救途径,利用体内游离的嘌呤或嘌呤核苷，经过简单的反应，合成嘌呤核苷酸的过程，称为补救合成（或重新利用）途径。,定义,补救合成的生理意义,补救合成节省从头合成时的
10、能量和一些氨基酸的消耗。 体内某些组织器官，如脑、骨髓等只能进行补救合成。,当全合成受阻时，微生物可从培养基中取得完整的嘌呤或嘧啶，和戊糖、磷酸通过酶的作用直接合成单核苷酸，所以称为“补救途径”。,嘌呤碱基、核苷和核苷酸之间能通过分段合成互相转变。,其中最重要的反应是：碱基 + PRPP 5- 核苷酸 + PPi,核苷酸焦磷酸化酶,合成过程,腺嘌呤磷酸核糖转移酶,次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶,嘧啶核苷酸的补救合成,核苷酸的补救合成途径 嘌呤碱基、核苷和核苷酸的相互转换,1-磷酸核糖,IMP合成系的代谢控制及嘌呤核苷酸互变的代谢控制,二、嘌呤核苷酸的代谢调节机制（枯草杆菌型）,AMP 脱氨酶,
11、SAMP 裂解酶,SAMP 合成酶,IMP 脱氢酶,GMP 还原酶,XMP 氨化酶,（5-磷酸核糖胺）,AICAR （5-胺基-4-氨甲酰咪唑核苷酸）,嘌呤核苷酸相互转换系的代谢控制,调节位点,A,PR-ATP 1- （5-磷酸核糖基）-三磷酸腺苷,AMP脱氨酶,SAMP裂解酶,SAMP合成酶,XMP氨化酶,GMP还原酶,IMP脱氢酶,AICAR5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷酸 PRA-（5-磷酸核糖胺）,磷酸核糖酰胺转移酶,嘌呤核苷酸的从头合成受到产物的反馈控制。第一个控制点是由5-磷酸核糖转变为磷酸核糖焦磷酸（PRPP），由核糖磷酸焦磷酸激酶催化。PRPP合成酶受ADP、ATP、GTP、UT
12、P抑制。第二个控制点是PRPP接受谷氨酰胺的氨基转变为5，-磷酸核糖胺（PRA），磷酸核糖酰胺转移酶受到ADP、ATP、AMP、GTP、GDP、GMP的反馈抑制。其中ADP、ATP、AMP结合在酶的一个抑制位点，而GTP、GDP、GMP结合在另一抑制位点。,IMP是AMP、GMP合成途径的分支点，每条分支途径的第一步反应也是控制点，GMP反馈抑制IMP向XMP转变，AMP则反馈抑制IMP转变为腺苷琥珀酸，从而防止生成过多的AMP和GMP。 GTP加速IMP向AMP转变，而ATP则可促进GMP的生成。这样可使酰嘌呤和鸟嘌呤核苷酸的水平保持相对平衡，满足核酸合成的需要。,以IMP为中心的两个循环，
13、各个反应是不可逆的,IMP脱氢酶受GMP的反馈抑制，也被GMP阻遏； ATP反馈抑制 GMP还原酶。同样的，AMP抑制SAMP合成酶，GTP抑制AMP脱氨酶,SAMPAMP反应的供能体为GTP，XMPGMP反应的供能体为ATP（即GTP加速IMP向AMP转变；ATP则促进GMP生成）,总结,根据上述调节机制，当细胞中的GMP水平提高到一定程度时，从IMP的代谢流就自动地转向AMP方面；反之，当细胞的AMP水平高到一定程度时，从IMP的代谢流就自动地转向GMP方面。,另一方面，核苷酸的代谢也与组氨酸的生物合成有关： AICARIMPAMPATPPR-ATPAICAR形成一个循环，由PRATP经咪
14、唑甘油磷酸生成组氨酸。假如组氨酸过剩，则不走此途径。,一、肌苷酸（IMP）：次黄嘌呤核苷酸，白色粉末状或颗粒状结晶，味鲜、易溶于水，难溶于有机溶剂。食品：鲜味添加剂医药：白细胞或血小板减少症，各种急慢性肝炎，肺原性心脏病，中心性视网膜炎，视神经萎缩症，毛地黄中毒症以及血吸虫病的治疗。生产方法：微生物直接发酵生产（一步法）；细菌发酵生产肌苷，然后采用化学发或酶法进行磷酸化；添加前体物次黄嘌呤，通过补救途径合成（半合成法）；利用微生物发酵生产腺苷或5，腺苷酸，再用化学法或酶法生产。,3 核酸类物质生产各论,PRPP转氨酶受到AMP、ADP、ATP和GMP反馈抑制，还受腺嘌呤的反馈阻遏。当使用腺嘌呤
15、缺陷型（Ade）突变株时，限制Ade添加量，既可以解除Ade系化合物对PRPP转酰胺酶的反馈抑制，而且避免了腺嘌呤对PRPP的反馈阻遏，为5，IMP积累建立了首要条件。,2、产氨短杆菌肌苷酸合成的代谢调控机制,1、PRPP转氨酶受到AMP、ADP、ATP和GMP反馈抑制，还受腺嘌呤的反馈阻遏。,2、 IMP脱氢酶受GMP 的反馈抑制，被鸟嘌呤阻遏,3、 SAMP合成酶受AMP、ADP、ATP的反馈调节,以腺嘌呤缺陷型（丧失SAMP合成酶）为出发菌株再诱变成Xan（黄嘌呤缺陷性，丧失IMP脱氢酶），不但切断了支路代谢，还可以通过限量添加Gua （鸟嘌呤）或Xan使GMP生成量减少，解除GMP对PRPP转酰胺酶的反馈抑制，保证肌苷酸大量积累。,3、肌苷和肌苷酸高产菌的选育模型,1）切断两条支路代谢， 切断支路：IMPSAMPAMP；IMPXMP，选育腺嘌呤缺陷型（Ade）和黄 嘌呤缺陷型（Xan）的双重缺陷型突变株； 2）通过限量腺嘌呤和鸟嘌呤来解除腺嘌呤系和鸟嘌呤系 化合物对IMP生物合成的酶的反馈抑制； 3）进一步选育抗腺嘌呤、鸟嘌呤类似物和（或）抗磺胺剂突变株，从遗传上解除正常代谢控制；选育8-AGr（抗8-氮鸟嘌呤）突变株 （选育抗性突变株时，应采用丧失腺嘌呤脱氢酶 的菌株为出发菌株）,
