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1、梅毒的实验室诊断 及其临床应用,安徽省立儿童医院检验科,一、概述,梅毒螺旋体即苍白密螺旋体的苍白亚种，人是其唯一宿主。直径0.10.15m，全长7-8m。在电镜下可见有细胞壁和细胞膜。新鲜标本在暗视野显微镜下可观察其形态和活泼的运动方式。 梅毒螺旋体对外界的抵抗力极弱，离体后1-2小时即死亡，对热和干燥特别敏感，4060时2 3分钟就能死亡，100时则即刻死亡。血液中4放置3天可死亡，因此4血库存放3天以上的血液无传染梅毒的危险。对肥皂水和常用化学消毒剂亦敏感，1%-2%石炭酸内数分钟就死亡；对化学药品也很敏感，肥皂水、来苏水、11000的高锰酸钾液对它都有杀灭作用。但是在缺氧的环境下它能生存
2、数天，在潮湿的衣服上也能存活数小时。了解了梅毒螺旋体的特性，我们就可以针对其弱点将它消灭。如将衣物放于阳光下曝晒，放在干燥的环境中储存；将用具煮沸消毒或用化学用品消毒，都能杀灭梅毒螺旋体，阻止它的传播。,梅毒螺旋体主要有两种抗原：1、密螺旋体抗原即梅毒螺旋体表面的特异抗原，与雅司病（皮肤损伤）、地方性梅毒（粘膜损伤） 、品他病（皮肤损伤）等3种密螺旋体有共同抗原，可交叉反应。2、非螺旋体抗原即磷脂类抗原，可刺激机体产生反应素，其与牛心肌的心脂质抗原发生反应，此法敏感性高，但有假阳性。 梅毒的免疫属感染性免疫，有梅毒螺旋体感染时才有免疫力，一旦螺旋体被杀灭，其免疫力随之消失。机体对梅毒螺旋体感染
3、可产生细胞免疫和体液免疫反应，体液免疫中有两种抗体：一种是梅毒特异性抗体，主要是IgG、IgM，对螺旋体有制动作用，当有补体存在时，可将其杀死和溶解，对机体的再感染有保护作用。另一种是抗脂质抗体的反应素，为IgG和IgM的混合物，对机体无保护作用。,梅毒主要是通过性接触传播，占95%以上，还可以通过胎盘传播给下一代，发生胎盘梅毒。还有一些比较少见的感染途径，如接吻、哺乳 等，此外输血也可以传播 。,二、临床表现及其分期,梅毒其病程漫长，临床表现极为复杂，几乎可侵犯全身各种组织和器官，可反复发作。早期主要侵犯皮肤黏膜，晚期侵犯内脏器官，严重者可引起严重的心血管系统和神经系统损害。,临床上分为获得
4、性梅毒（后天梅毒）和先天性梅毒（胎盘梅毒），获得性梅毒根据其发展经过一般分为三期。 一期梅毒：一般在感染后的3周发生，主要表现为硬下疳。 二期梅毒：发生于感染后的6-8周。主要表现为全身皮肤粘膜出现梅毒疹。 三期梅毒：发生于感染后的2年，可出现皮下树胶肿（梅毒瘤）、神经梅毒、心血管梅毒。,三、实验室诊断,（一）、显微镜检查：直接观察分泌物中的梅毒螺旋体，如见到运动活泼的苍白螺旋体可直接诊断梅毒，是最特异、最准确的诊断方法，但灵敏度低。 暗视野显微镜检查（DF） 直接免疫荧光检查 镀银染色法 多功能显微诊断仪（MDI）,暗视野显微镜检查（DF） 是诊断早期梅毒唯一可靠的实验室方法，特别是血清学反
5、应阴性者，镜检阳性有确诊意义，可直接观察到病灶分泌物中的梅毒螺旋体。该方法不仅操作简单，且经济 、快速，但此法对晚期及隐性梅毒或口腔病灶标本不适用。 期梅毒-取硬下疳渗出液； 期梅毒-取梅毒疹渗出液或局部淋巴抽出液。 对期梅毒末期以后（大约感染3-4周以后）的病人可分离血清检查有无梅毒螺旋体抗体和反应素。,直接免疫荧光检查 弥补了DF的缺点，可用于口腔病灶的检查。 镀银染色法 梅毒螺旋体染成棕黑色，背景染成淡棕色。银染色的阳性结果需谨慎解释，因为类似梅毒螺旋体的其他物质易混淆。 多功能显微诊断仪（MDI） 是近年来国外开发的一种综合相差对比、暗视野及偏振光的可变投影显微镜，其特点是待检查标本不
6、需染色及任何加工处理，而是将“活的”真实的样品直接进行观察，具有直接、方便、快速的优点。但整套仪器价格昂贵，很难普及到各个梅毒检测实验室。,镀银染色法 梅毒螺旋体染成棕黑色，背景染成淡棕色。,（二）、血清学实验 是诊断梅毒的主要方法 根据所用抗原不同可分为两类： 非梅毒螺旋体抗原血清试验 梅毒螺旋体抗原血清试验,非梅毒螺旋体抗原血清试验 原理 梅毒螺旋体破坏宿主细胞释放类脂物质，同时它自己细胞表面也可以释放这种类脂物质，类脂物质刺激机体产生抗类脂抗体（抗心磷脂），在体外该抗体与心磷脂、卵磷脂和胆固醇组成的抗原反应，形成凝集反应（抗原抗体凝集反应）。 目前为多数医院的梅毒常规筛查试验。这类试验可
7、观察疗效、复发及再感染，适于二期梅毒的诊断，而不适于诊断一、三期梅毒，包括潜伏梅毒、神经梅毒的诊断。,方法 性病研究实验室试验（venereal disease research laboratory test，VDRL） ：美国Pangborn等发现一种性病研究实验室抗原（VDRL），是从牛心肌中提取的心拟脂，适量加入胆固醇及卵磷脂以提高敏感性，通常称这种抗原为心拟脂抗原。VDRL试验属于微量玻片法，是唯一推荐用于检测脑脊液反应素的试验，对诊断神经梅毒具有重要价值，可作定量及定 性试验，操作简单，试剂及对照血清已标准化，费用低。但对一期梅毒敏感性不高。因抗原制备复杂，已少用。 不加热血清反应
8、素试验（USR）：为VDRL的改良方法。现在我国目前广泛采用。血清不需加热灭活，节省操作时间，但主观性强，易出现漏检。USR与RPR试验可作为疗效观察或随访是否复发或再感染的指征。,快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）：是80年代问世的非特异性梅毒血清学试验，所用抗原为标准的牛心肌脂抗原，胶体炭作为指示剂，该方法操作简便、迅速，适用于大量标本检测，目前许多血站用RPR试验对献血者进行梅毒普查。RPR试验和DF方法对一期梅毒的诊断相互配合，可早期诊断梅毒。缺点是当抗体含量过高时，易出现假阴性反应，即前带现象，会有漏检；还易出现生物学假阳性反应。对潜伏期梅毒、神经梅毒不敏感。 甲苯胺红不加热血清试
9、验（TRUST）：TRUST试验所用的抗原是心磷脂、卵磷脂及胆固醇，甲苯胺红作为指示剂。试验结果清晰易读，简便快速，稳定性好，TRUST法比RPR、USR效价测定高一个滴度。缺点是许多因素影响结果，如高脂血症和抗心磷脂抗体阳性的血清均可干扰而出现假阳性结果。,非特异性抗体检测试验总结,优点：敏感性高，经济、方便、快速，便于在一般实验室推广，不仅适用于一、二期梅毒的诊断、疗效观察和复发、再感染的检测，还适用于大规模筛选且能够定量，在有效的治疗后该类试验的抗体滴度将逐渐下降至转阴。 缺点：特异性低，对于患有系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、疟疾等疾病的患者易出现假阳性; 易出现前带现象而呈假阴性；对I
10、期梅毒早期、III期梅毒及治疗后梅毒，潜伏期梅毒及神经性梅毒不敏感。,梅毒螺旋体抗原血清试验 用活的或死的梅毒螺旋体或其成分来作抗原测定抗螺旋体抗体。这种试验敏感性和特异性均高，一般用作确认试验。这种试验是检测血清中抗梅毒螺旋体IgG或IgM抗体，该抗体即使患者经过足够治疗，仍能长期存在，甚至终身不消失，血清反应持续存在阳性，因此，不能用于观察疗效。 方法： （1）荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）：是一种间接免疫荧光法，被认为是检测梅毒的金标准。以Reiter株抗原吸收待检血清，保证了试验结果的特异性；以整条梅毒螺旋体检测血清中抗体，提高了试验的敏感性。文献报道FTA-ABS对各期
11、梅毒检测的特异性达到92%，对一期梅毒的敏感性为80%，二期为99%100%，三期为95%100%。它的主要缺点是需荧光显微镜设备，当标本荧光微弱，病情可疑时，试验结果判定常带有主观色彩。美国常用此试验作为梅毒的确认试验。,（2）梅毒螺旋体血凝试验（TPHA）：采用经超声裂解的梅毒螺旋体作为抗原，致敏绵羊或禽类红细胞作为载体加入患者血清做血凝试验，若血清中存在抗梅毒螺旋体特异性抗体，就可出现肉眼可见的凝聚， 是目前国内许多医院常用的梅毒血清确认试验。试剂制备过程排除了各种非特异性反应，因此 TPHA的敏感性和特异性较高。缺点是试剂成本较高，操作较麻烦，且易发生自凝现象和生物学假阳性。 （3）梅
12、毒螺旋体明胶凝聚实验（TPPA）：作为梅毒抗体检测的确证方法， 原理同TPHA实验，只是用明胶作为载体，但敏感性、特异性、稳定性、凝集反映判读的清晰性等各方面均优于TPHA ，但价格昂贵且结果判断难以自动化。,（4）梅毒螺旋体免疫印迹试验（western immunoblotting technique）是80年代发展起来的一种检测技术，它结合了免疫学和分子生物学的特点，敏感性高，特异性强。Dettori等认为免疫印迹法用于梅毒诊断优于FTA-ABS和TPHA方法，对二期梅毒或早期潜伏梅毒、神经梅毒的阳性率均为100%，对于非螺旋体标本（包括正常标本、生物学假阳性标本以及球蛋白增高或抗核抗体的
13、标本）检测没有假阳性或可疑反应。免疫印迹法操作简便，不要求试验仪器和环境，结果容易判定，但成本较高。,（5）梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,TP-ELISA）TP-ELISA方法检测梅毒螺旋体最早出现于1975年，是用双抗原夹心法测定梅毒特异性抗体。TP-ELISA方法主要检测梅毒螺旋体IgG和IgM抗体，文献报道TP-ELISA方法的敏感性高于FTA-ABS方法，对期梅毒的诊断灵敏度为93.8%，诊断特异性为100%。TP-ELISA方法检测操作简便，不受样本中纤维蛋白和溶血等影响，一次可进行多份样本的检测，用酶标仪分析，客观准
14、确，结果便于保留及标准化管理，可用作筛查和确认试验。因此，TP-ELISA方法被公认为梅毒血清学诊断实验的首选方法。,（6）梅毒螺旋体制动试验（TPI）：但操作复杂，设备要求高且耗时，现已少用。只用于研究工作。,实验方法分类,(三)、基因诊断技术检测梅毒螺旋体（TP-PCR） TP-PCR检测梅毒螺旋体DNA，特异性强，敏感性高，是目前诊断梅毒螺旋体的先进方法,是最为理想的梅毒初筛方法,可以最大限度的检出各期梅毒。 由于临床标本可能含有大量人细胞和微生物，建立对梅毒螺旋体高度特异的PCR方法是很重要的，目前国内TP-PCR试剂盒的质量有待改进。,我中心项目组合,TP-ELISA - ,TRUS
15、T - 可基本排除梅毒；极早期梅毒（无任何抗梅毒抗体产生）。 TP-ELISA + ,TRUST - 早期梅毒、晚期梅毒、治愈的早期梅毒（应询问病人是否有既往的梅毒感染和治疗史）、 母体抗体。 TP-ELISA +,TRUST + 现正梅毒，应考虑治疗。 TP-ELISA - ,TRUST + TRUST 假阳性,结语,总之，及早、准确地诊断梅毒需要梅毒实验室的检测，所以选择一种敏感性和特异性均高的检测方法非常重要。目前，国内实验室用梅毒非特异性试验（如RPR法、TRUST法）进行梅毒的常规筛查及疗效观察、判断复发及再感染，用梅毒特异性试验（如FTA-ABS、TPPA或ELISA法）进行确认试验，用于诊断各期梅毒。这些试验各有优缺点，研究人员仍在寻找敏感、准确、全面的检测方法。,Thank you !,
