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1、梅毒的实验室诊断 及其临床应用,安徽省立儿童医院检验科,一、概述,梅毒螺旋体即苍白密螺旋体的苍白亚种,人是其唯一宿主。直径0.10.15m,全长7-8m。在电镜下可见有细胞壁和细胞膜。新鲜标本在暗视野显微镜下可观察其形态和活泼的运动方式。 梅毒螺旋体对外界的抵抗力极弱,离体后1-2小时即死亡,对热和干燥特别敏感,4060时2 3分钟就能死亡,100时则即刻死亡。血液中4放置3天可死亡,因此4血库存放3天以上的血液无传染梅毒的危险。对肥皂水和常用化学消毒剂亦敏感,1%-2%石炭酸内数分钟就死亡;对化学药品也很敏感,肥皂水、来苏水、11000的高锰酸钾液对它都有杀灭作用。但是在缺氧的环境下它能生存
2、数天,在潮湿的衣服上也能存活数小时。了解了梅毒螺旋体的特性,我们就可以针对其弱点将它消灭。如将衣物放于阳光下曝晒,放在干燥的环境中储存;将用具煮沸消毒或用化学用品消毒,都能杀灭梅毒螺旋体,阻止它的传播。,梅毒螺旋体主要有两种抗原:1、密螺旋体抗原即梅毒螺旋体表面的特异抗原,与雅司病(皮肤损伤)、地方性梅毒(粘膜损伤) 、品他病(皮肤损伤)等3种密螺旋体有共同抗原,可交叉反应。2、非螺旋体抗原即磷脂类抗原,可刺激机体产生反应素,其与牛心肌的心脂质抗原发生反应,此法敏感性高,但有假阳性。 梅毒的免疫属感染性免疫,有梅毒螺旋体感染时才有免疫力,一旦螺旋体被杀灭,其免疫力随之消失。机体对梅毒螺旋体感染
3、可产生细胞免疫和体液免疫反应,体液免疫中有两种抗体:一种是梅毒特异性抗体,主要是IgG、IgM,对螺旋体有制动作用,当有补体存在时,可将其杀死和溶解,对机体的再感染有保护作用。另一种是抗脂质抗体的反应素,为IgG和IgM的混合物,对机体无保护作用。,梅毒主要是通过性接触传播,占95%以上,还可以通过胎盘传播给下一代,发生胎盘梅毒。还有一些比较少见的感染途径,如接吻、哺乳 等,此外输血也可以传播 。,二、临床表现及其分期,梅毒其病程漫长,临床表现极为复杂,几乎可侵犯全身各种组织和器官,可反复发作。早期主要侵犯皮肤黏膜,晚期侵犯内脏器官,严重者可引起严重的心血管系统和神经系统损害。,临床上分为获得
4、性梅毒(后天梅毒)和先天性梅毒(胎盘梅毒),获得性梅毒根据其发展经过一般分为三期。 一期梅毒:一般在感染后的3周发生,主要表现为硬下疳。 二期梅毒:发生于感染后的6-8周。主要表现为全身皮肤粘膜出现梅毒疹。 三期梅毒:发生于感染后的2年,可出现皮下树胶肿(梅毒瘤)、神经梅毒、心血管梅毒。,三、实验室诊断,(一)、显微镜检查:直接观察分泌物中的梅毒螺旋体,如见到运动活泼的苍白螺旋体可直接诊断梅毒,是最特异、最准确的诊断方法,但灵敏度低。 暗视野显微镜检查(DF) 直接免疫荧光检查 镀银染色法 多功能显微诊断仪(MDI),暗视野显微镜检查(DF) 是诊断早期梅毒唯一可靠的实验室方法,特别是血清学反
5、应阴性者,镜检阳性有确诊意义,可直接观察到病灶分泌物中的梅毒螺旋体。该方法不仅操作简单,且经济 、快速,但此法对晚期及隐性梅毒或口腔病灶标本不适用。 期梅毒-取硬下疳渗出液; 期梅毒-取梅毒疹渗出液或局部淋巴抽出液。 对期梅毒末期以后(大约感染3-4周以后)的病人可分离血清检查有无梅毒螺旋体抗体和反应素。,直接免疫荧光检查 弥补了DF的缺点,可用于口腔病灶的检查。 镀银染色法 梅毒螺旋体染成棕黑色,背景染成淡棕色。银染色的阳性结果需谨慎解释,因为类似梅毒螺旋体的其他物质易混淆。 多功能显微诊断仪(MDI) 是近年来国外开发的一种综合相差对比、暗视野及偏振光的可变投影显微镜,其特点是待检查标本不
6、需染色及任何加工处理,而是将“活的”真实的样品直接进行观察,具有直接、方便、快速的优点。但整套仪器价格昂贵,很难普及到各个梅毒检测实验室。,镀银染色法 梅毒螺旋体染成棕黑色,背景染成淡棕色。,(二)、血清学实验 是诊断梅毒的主要方法 根据所用抗原不同可分为两类: 非梅毒螺旋体抗原血清试验 梅毒螺旋体抗原血清试验,非梅毒螺旋体抗原血清试验 原理 梅毒螺旋体破坏宿主细胞释放类脂物质,同时它自己细胞表面也可以释放这种类脂物质,类脂物质刺激机体产生抗类脂抗体(抗心磷脂),在体外该抗体与心磷脂、卵磷脂和胆固醇组成的抗原反应,形成凝集反应(抗原抗体凝集反应)。 目前为多数医院的梅毒常规筛查试验。这类试验可
7、观察疗效、复发及再感染,适于二期梅毒的诊断,而不适于诊断一、三期梅毒,包括潜伏梅毒、神经梅毒的诊断。,方法 性病研究实验室试验(venereal disease research laboratory test,VDRL) :美国Pangborn等发现一种性病研究实验室抗原(VDRL),是从牛心肌中提取的心拟脂,适量加入胆固醇及卵磷脂以提高敏感性,通常称这种抗原为心拟脂抗原。VDRL试验属于微量玻片法,是唯一推荐用于检测脑脊液反应素的试验,对诊断神经梅毒具有重要价值,可作定量及定 性试验,操作简单,试剂及对照血清已标准化,费用低。但对一期梅毒敏感性不高。因抗原制备复杂,已少用。 不加热血清反应
8、素试验(USR):为VDRL的改良方法。现在我国目前广泛采用。血清不需加热灭活,节省操作时间,但主观性强,易出现漏检。USR与RPR试验可作为疗效观察或随访是否复发或再感染的指征。,快速血浆反应素环状卡片试验(RPR):是80年代问世的非特异性梅毒血清学试验,所用抗原为标准的牛心肌脂抗原,胶体炭作为指示剂,该方法操作简便、迅速,适用于大量标本检测,目前许多血站用RPR试验对献血者进行梅毒普查。RPR试验和DF方法对一期梅毒的诊断相互配合,可早期诊断梅毒。缺点是当抗体含量过高时,易出现假阴性反应,即前带现象,会有漏检;还易出现生物学假阳性反应。对潜伏期梅毒、神经梅毒不敏感。 甲苯胺红不加热血清试
9、验(TRUST):TRUST试验所用的抗原是心磷脂、卵磷脂及胆固醇,甲苯胺红作为指示剂。试验结果清晰易读,简便快速,稳定性好,TRUST法比RPR、USR效价测定高一个滴度。缺点是许多因素影响结果,如高脂血症和抗心磷脂抗体阳性的血清均可干扰而出现假阳性结果。,非特异性抗体检测试验总结,优点:敏感性高,经济、方便、快速,便于在一般实验室推广,不仅适用于一、二期梅毒的诊断、疗效观察和复发、再感染的检测,还适用于大规模筛选且能够定量,在有效的治疗后该类试验的抗体滴度将逐渐下降至转阴。 缺点:特异性低,对于患有系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、疟疾等疾病的患者易出现假阳性; 易出现前带现象而呈假阴性;对I
10、期梅毒早期、III期梅毒及治疗后梅毒,潜伏期梅毒及神经性梅毒不敏感。,梅毒螺旋体抗原血清试验 用活的或死的梅毒螺旋体或其成分来作抗原测定抗螺旋体抗体。这种试验敏感性和特异性均高,一般用作确认试验。这种试验是检测血清中抗梅毒螺旋体IgG或IgM抗体,该抗体即使患者经过足够治疗,仍能长期存在,甚至终身不消失,血清反应持续存在阳性,因此,不能用于观察疗效。 方法: (1)荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS):是一种间接免疫荧光法,被认为是检测梅毒的金标准。以Reiter株抗原吸收待检血清,保证了试验结果的特异性;以整条梅毒螺旋体检测血清中抗体,提高了试验的敏感性。文献报道FTA-ABS对各期
11、梅毒检测的特异性达到92%,对一期梅毒的敏感性为80%,二期为99%100%,三期为95%100%。它的主要缺点是需荧光显微镜设备,当标本荧光微弱,病情可疑时,试验结果判定常带有主观色彩。美国常用此试验作为梅毒的确认试验。,(2)梅毒螺旋体血凝试验(TPHA):采用经超声裂解的梅毒螺旋体作为抗原,致敏绵羊或禽类红细胞作为载体加入患者血清做血凝试验,若血清中存在抗梅毒螺旋体特异性抗体,就可出现肉眼可见的凝聚, 是目前国内许多医院常用的梅毒血清确认试验。试剂制备过程排除了各种非特异性反应,因此 TPHA的敏感性和特异性较高。缺点是试剂成本较高,操作较麻烦,且易发生自凝现象和生物学假阳性。 (3)梅
12、毒螺旋体明胶凝聚实验(TPPA):作为梅毒抗体检测的确证方法, 原理同TPHA实验,只是用明胶作为载体,但敏感性、特异性、稳定性、凝集反映判读的清晰性等各方面均优于TPHA ,但价格昂贵且结果判断难以自动化。,(4)梅毒螺旋体免疫印迹试验(western immunoblotting technique)是80年代发展起来的一种检测技术,它结合了免疫学和分子生物学的特点,敏感性高,特异性强。Dettori等认为免疫印迹法用于梅毒诊断优于FTA-ABS和TPHA方法,对二期梅毒或早期潜伏梅毒、神经梅毒的阳性率均为100%,对于非螺旋体标本(包括正常标本、生物学假阳性标本以及球蛋白增高或抗核抗体的
13、标本)检测没有假阳性或可疑反应。免疫印迹法操作简便,不要求试验仪器和环境,结果容易判定,但成本较高。,(5)梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,TP-ELISA)TP-ELISA方法检测梅毒螺旋体最早出现于1975年,是用双抗原夹心法测定梅毒特异性抗体。TP-ELISA方法主要检测梅毒螺旋体IgG和IgM抗体,文献报道TP-ELISA方法的敏感性高于FTA-ABS方法,对期梅毒的诊断灵敏度为93.8%,诊断特异性为100%。TP-ELISA方法检测操作简便,不受样本中纤维蛋白和溶血等影响,一次可进行多份样本的检测,用酶标仪分析,客观准
14、确,结果便于保留及标准化管理,可用作筛查和确认试验。因此,TP-ELISA方法被公认为梅毒血清学诊断实验的首选方法。,(6)梅毒螺旋体制动试验(TPI):但操作复杂,设备要求高且耗时,现已少用。只用于研究工作。,实验方法分类,(三)、基因诊断技术检测梅毒螺旋体(TP-PCR) TP-PCR检测梅毒螺旋体DNA,特异性强,敏感性高,是目前诊断梅毒螺旋体的先进方法,是最为理想的梅毒初筛方法,可以最大限度的检出各期梅毒。 由于临床标本可能含有大量人细胞和微生物,建立对梅毒螺旋体高度特异的PCR方法是很重要的,目前国内TP-PCR试剂盒的质量有待改进。,我中心项目组合,TP-ELISA - ,TRUS
15、T - 可基本排除梅毒;极早期梅毒(无任何抗梅毒抗体产生)。 TP-ELISA + ,TRUST - 早期梅毒、晚期梅毒、治愈的早期梅毒(应询问病人是否有既往的梅毒感染和治疗史)、 母体抗体。 TP-ELISA +,TRUST + 现正梅毒,应考虑治疗。 TP-ELISA - ,TRUST + TRUST 假阳性,结语,总之,及早、准确地诊断梅毒需要梅毒实验室的检测,所以选择一种敏感性和特异性均高的检测方法非常重要。目前,国内实验室用梅毒非特异性试验(如RPR法、TRUST法)进行梅毒的常规筛查及疗效观察、判断复发及再感染,用梅毒特异性试验(如FTA-ABS、TPPA或ELISA法)进行确认试验,用于诊断各期梅毒。这些试验各有优缺点,研究人员仍在寻找敏感、准确、全面的检测方法。,Thank you !,