紫外可见分光光度法在食品中的应用

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1、紫外可见分光光度法在食品中的应用09 质量钱丹20090803109 紫外可见分光光度法是利用物质分子对紫外可见光谱区的辐射的吸收来进 行分析的一种仪器分析方法。 这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电 子在电子能级间的跃迁， 它广泛用于无机和有机物质的定性和定量分析。朗伯一 比耳定律 (Lambert Beer) 是光吸收的基本定律，俗称光吸收定律，是分光光度 法定量分析的依据和基础。当入射光波长一定时，溶液的吸光度A是吸光物质的 浓度C及吸收介质厚度 l( 吸收光程 ) 的函数。紫外可见分光光度计是基于紫外可见 分光光度法的原理丁作的常规分析仪器。根据光路设计的不同， 紫外可见分光光

2、 度计可以分为单光束分光光度计、双光束分光光度计和双波长分光光度计。各种 型号的紫外可见分光光度计，就其基本结构来说，都是由5个基本部分组成，即 光源、单色器、吸收池、检测器及信号指示系统。这里着重介绍的是食品检测中 应用的上海元析紫外可见分光光度计，其使用波长范围为1901100 nm ，光谱带 宽1 nm ( 固定) ，准双光束， 紫外可见分光光度计在食品检测中的应用 当分子中含有 1个或更多的生色基团 ( 即具有不饱和键的原子基团)，辐射就 会引起分子中电子能量的改变。 常见的生色基团有： C=0， 一N=N 一，一N=O ， 一 C；N， C=S 如果2个生色基团之间只隔 1个碳原子，

3、则形成共轭基团，会使吸收 带移向较长的波长处 ( 即红移 )，且吸收带的强度显著增加； 当分子中含有助色基 团(0时) ，也会产生红移效应。常见的助色基团有：一OH ， 一NH2 ， 一SH ， 一 C1， 一Br， 一I 这些基团在食品和食品添加剂中大量存在，所以紫外分光光度 计在食品检测中的应用有着无可比拟的优越性，其主要用途有以下几点。 1. 光度测量 在食品生产中为了保证有颜色的饮料( 如可乐、果汁及茶饮料 ) 产品的颜色一 致，可以在可见光区用紫外可见分光光度计来测定其吸光度值，使色差符合产品 要求。在发酵业中也可通过测定吸光度值来确定产品的发酵完成程度。对于一些 成分比较单一的产品

4、也可通过测定吸光度值来确定产品合格与否。比如，判定营 养增强剂维生素 Bl的质量就可以在 400 nm下测定其吸光度值，当其值不超过 0020时，即可确定为合格品。 2. 成分的定性分析 物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特 定波长的光能量， 相应发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。由于各 种物质具有各自不同的分子、 原子和不同的分子空间结构， 其吸收光能量的情况 也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸 收光谱上的某些特性波长处的最大吸收峰( 峰值) 和波形图来判断某种物质是否 存在。在食品生产中会使用一些食品添加剂，为了确定

5、食品添加剂的质量，可以 用紫外可见分光光度计对其进行光谱扫描。例如，对食品中涉及的一些复合甜味 剂、 复合防腐剂和复合鲜味剂等就可以用紫外可见分光光度计进行一个全面扫描 以排除违禁添加剂的使用。 另外，此方法还可以在物质结构分析方面作为红外光 谱(IR) 、核磁共振 (NMR) 、质谱 (Ms)等方法的辅助手段。 3.DNA 蛋白分析 DNM 蛋白质为生物大分子， 所产生的紫外光吸收往往是其分子内的小基团所 引起的，例如嘌呤碱、嘧啶碱、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和肽键等。嘌呤碱、嘧啶碱以及由它们参与组成的核苷、核苷酸及核酸对紫外光有强烈的吸收，在吸 收波长 260 nm处有最大吸收值。在蛋白质分

6、子中，酪氨酸(T 、苯丙氨酸 (Phe) 、 色氨酸 (Trp) 残基的苯环含有共轭双键， 该共轭双键对紫外光有吸收( 其中最大吸收 Tyr在吸收波长 274 fiB ；Phe在吸收波 长257 nm；Trp在吸收波长 280 Flm) ，从而导致蛋白质对紫外光有吸收。肽键对 紫外光的最大吸收在吸收波长238 nm 。利用这个特性可以准确、可靠地测定乳制 品中蛋白质含量。 紫外- 可见分光光度计在食品酶分析中的应用 1. 一半乳糖苷酶一半乳糖苷酶， 又称乳糖酶 (Lactase) 。能水解乳 糖来降低乳制品的乳糖含量， 从而提高乳制品的可消化性， 用于低乳糖牛奶和非 结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪

7、风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。 2. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶 (Superoxide Dismutase，简称SOD) 是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂， 保护细胞免受损伤。 SOD 广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含 有SOD 。自1969年Mccord等人首次发现了 SOD 生物活性后， 医学界对其医疗作用做 了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等 作用，被专家称为 21世纪最有前途的药用酶。欧美国家已开始将其应用于医疗、 食品、保健、化妆品等领域。 3. 多酚氧化酶多酚氧化酶 (PPO)是一

8、类由核基因编码在细胞质中合成 的含铜质体的金属酶，其作用机理在于铜的氧化- 还原作用。大麦中的多酚物质 经过PPO 的催化氧化后，具有单宁性质，易和蛋白质起交联作用而沉淀出来，进 而影响啤酒的色泽、泡沫、风味和非生物稳定性。大麦中部分PPO 以“潜伏”状 态存在，在浸麦过程中， 可通过去除一些酶抑制剂、 蛋白酶作用或其他的一些方 式使其活性在浸麦过程中提高。在大麦发芽过程中，PPO 的活力较高，影响着麦 芽的质量。因此，在制麦过程中应该降低PPO 活性。 4. 葡萄糖氧化酶上世纪 60年代以前，葡萄糖氧化酶主要用于蛋品加工 业，除去葡萄糖，防止发生 Maillard 反应，稳定产品质量，延长保

9、质期。80年代 末，又陆续开发了去除啤酒溶解氧和瓶颈氧改善风味延长保质期、果汁果酒除氧 护色稳定质量、 面粉品质改善、 海产品和肉类保鲜、 饲料添加去氧平衡畜禽胃肠 代谢等用途，并建立了葡萄糖氧化酶专业生产车间。 5. 果胶酶果胶酶可以改善葡萄酒的色泽、增加酒香，并提高葡萄酒出 汁率等，对提高红葡萄酒的品质有重要作用。向具塞试管中加入 1.8mL 0.30% 聚半乳糖醛酸溶液 (用0.05 mol/L Na2CO3/NaHCO3缓冲溶液配制，调节 pH 10.0) ， 于55水浴下保温 5 min ，然后加入一定稀释倍数的酶液0.2 mL反应15 min ，加 入DNS 试剂1.5 mL ，混

10、匀，在沸水中加热 10min，立即用自来水冷却，再加入21.5 mL 蒸馏水，混匀，于分光光度计上520 nm 测定吸光度。空白用煮沸失活的酶液代 替。 6. 胰-淀粉酶用移液管将 0.5 mL 酶溶液移入试管， 并在水浴中调温至 25。加 0.5 mL已同样预热到 25的1% 淀粉溶液。 3 min后加1.0 mL DNS 显色剂。 置试管于沸水中 5 min，冷却后用 10 mL 蒸馏水稀释。用分光光度计于540 nm 处以 空白作对照测定吸光度。以0.5 mL磷酸盐缓冲液代替酶液测定空白值。 7. 植酸酶以植酸钠为底物， 采用钒钼酸铵法测定植酸酶的酶活。吸取1 mmol/l 的植酸钠 (

11、酶作用底物，用 0.25 mol/l、pH值5.50醋酸- 醋酸钠缓冲液配 制)1.0 ml ，37 oC预热5 min后，准确加入适当稀释的酶液0.5 ml( 对照组先加反应终止液 )，37 oC水浴反应 30min后，再加入 4 ml 反应终止液 ( 现用现配 ) 冷却至 室温，在 415 nm处测定OD 值，利用无机磷标准曲线计算出酶活。 8. 羧甲基纤维素酶在0.5mL适当稀释的酶液中加入质量分数为0.625% 的羧甲基纤维素钠溶液，于50水浴中保温 30min，加2.0 mL质量分数为 10% 的 NaOH 溶液终止反应，再加入 2.5mLDNS 试剂，于沸水浴中煮沸 15min，冷

12、却，在550 nm 波长处比色，要求光密度读数尽可能在标准曲线的0. 5 mg 葡萄糖处。每次测 定均设立空白对照，对照管先加入0.5mL酶液，然后加入 2. 0 mL 质量分数为 10% 的NaOH 溶液将酶灭活，再依次加入质量分数为0.625% 的底物 2. 0 mL ，与待测管 一起保温，加入 DNS ，煮沸、冷却、稀释比色、与标准曲线对照。 9. 木聚糖酶木聚糖酶能水解不可溶戊聚糖(阿拉伯木聚糖 ) ，使其成为 水溶性的，水解率达 65% 。面粉中增加水溶性阿拉伯木聚糖，能提高面团的持水 性和机械强度， 使面团具有更好的持气能力和操作耐力，进而提高馒头和面包的 品质。以木聚糖为底物，用

13、 DNS 法测定还原糖的生成量。取稀释酶液0.1ml ，加1% 木聚糖液 0.9ml ，置50水浴保温 30min后，加 DNS 2ml 于沸水浴中显色 3min，用 自来水冷却后，加蒸馏水定容25ml，测O.D值。每毫升酶液每分钟水解木聚糖生 成1mol木糖所相当的酶量。 10. 蛋白酶中性蛋白酶在一定的温度和pH 条件下 , 水解酪素底物产生含 有酚基的氨基酸 , 在碱性条件下 , 将福林试剂还原 , 生成钼蓝与钨蓝 , 其颜色深浅 与酚基氨基酸含量成正比。通过在660 nm测定其吸光度 , 可得到酶解产生的酚基 氨基酸的量 , 计算出蛋白酶活力 , 以此代表蛋白酶的总酶活力。 11. -

14、 淀粉酶在10 mL 试管中依次加入 0. 5% 可溶性淀粉溶液 1 mL , pH 4. 2 的磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液 2. 5 mL, 40 预热 10 min 。然后加入多倍稀 释的0. 5 mL 酶液, 40 保温 5 min后, 加入0. 1 mol/L H2 SO4 1 mL 终止反应。 再取2 mL 反应液与 0. 5% KI - I2 溶液0. 5 mL 显色, 测定OD620 。与淀粉梯度标 准曲线对照得反应液淀粉浓度后, 计算酶活力。 12. 脂肪酶利用脂肪酶作用后释放出的链较短的脂肪酸，增加和改进食 品的风味和香味 ; 利用脂肪酶催化的醇解和酯化反应来生产各种香精酯，

15、作调料 剂; 用有专一性的微生物脂肪酶提高食用油营养价值和增加食用油的花色品种， 制备代可可酯等高档油脂; 另外，脂肪酶还可以用于酒类的去浊除渣、改善面包 质量、改善蛋白的发泡等方面。 13. 漆酶3.0mL反应液中含 20 mmol/LABTS 0.7mL，酶液 0.lmL 和25 mmol/L琥珀酸缓冲液 (pH4.5) ，在25下反应 2min后立即用冰浴终止反应，测定 436nm 处吸光度的增量。 14. 木质素过氧化物酶30条件下反应体系中含酶液，浓度为 0.2mol/L ，且pH 值为2.4 的酒石酸缓冲液及浓度为 0.008mol/L 的黎芦醇各 lmL，加 人浓度为 0.016mol/L 的H2O2 lmL 启动反应， 测定反应最初 4min内在310nm 处的吸 光度，以灭过酶活的酶液作对照。 15. 锰过氧化物酶室温下反应体系中含有 50mmol/L pH4.5的乳酸钠缓 冲液3.4mL，1.6mmol/L的MnSO4 溶液0.lrnL ，酶液0.4rnL ，加人1.6 mmol/L的H2O2 0.lmL 启动反应。测定反应最初 4min内在240nm 处的吸光度。 总之， 紫外可见分光光度计几乎可以满足广大中小食品企业食品检测分析的 需要。随着科学技术的发展， 紫外可见分光光度计还可和其他分析仪器联机使其 应用范围更加广泛，能在更多的领域发挥作用。