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1、第一篇 发酵生产技术模块,第一章 菌种管理技术模块,微生物工程的工业生产水平由三个要素决定，即生产菌种的性能，发酵提纯工艺条件和生产设备，其中优良菌种是最重要的。 在应用微生物加工制造和发酵生产各种食品的过程中，要想有效地大幅度提高产品的产量、质量和花色品种,必须选育优良的生产菌种，才能达到目的。由于微生物在传代过程中不断产生变异，因此，菌种选育获得的优良性状不可能永久地保持下去，只能减慢退化速度，这就需要通过创造适宜的环境来限制退化速度，这就是菌种保藏工作。不言而喻，菌种保藏对于微生物工业生产是极其重要和不可缺少的。,在微生物工业应用中， 微生物菌种工作主要包括以下四方面： 菌种的分离筛选：
2、挑选符合生产要求的菌种，这是选种工作的任务。 菌种培育： 改良已有菌种的生产性能，使产品的质和量不断提高，或使它更适应于工艺的要求，这是育种工作的任务。 菌种的保藏： 一切生产菌种都要使它避免死亡和生产性能的下降，这是菌种保藏工作的任务。 退化菌种的复壮： 如果发现菌种的生产性能下降，就要设法使它恢复，这便是菌种复壮工作的任务。,第一节 微生物代谢调控,微生物细胞的代谢调节方式很多，例如可调节营养物质透过细胞膜而进入细胞的能力，通过酶的定位以限制它与相应底物的接近，以及调节代谢流等。其中以调节代谢流的方式最为重要，它包括两个方面，一是“粗调”，即调节酶的合成量，二是“细调”，即调节现成酶分子的
3、催化活力，两者往往密切配合和协调，以达到最佳调节效果。 利用微生物代谢调控能力的自然缺损或通过人为选育的方法获得突破代谢调控的变异菌株，可为发酵工业提供生产有关代谢产物的高产菌株。,第二节 菌种选育,微生物菌种选育的理论基础是微生物遗传学和分子遗传学。优良菌种的选育是在微生物遗传变异的基础上进行的。遗传和变异是相互关联，同时又相互矛盾对立的两个方面，在一定条件下，二者是相互转化的。认识和掌握微生物遗传变异的规律是搞好菌种选育和关键。菌种选育的内容涉及范围非常广，最主要的部分是基因突变的突变型菌株的识别与筛选两部分。,一、微生物菌种选育的理论基础,（一）微生物的遗传和变异性1、遗传2、变异遗传和
4、变异现象是生物最基本的特性。遗传是相对的，变异是绝对的。遗传中包含变异，变异中包含遗传。3、微生物的遗传和变异性的特点由于微生物繁殖快、个体小，受环境影响大，易于变异。变异后能很快在性状上表现出来。微生物的变异包含稳定性变异和不稳定性变异。,（二）遗传变异的物质基础 1、研究历史孟德尔 豌豆杂交实验摩尔根 确认遗传因子Miescher 发现核酸证明核酸是遗传变异物质基础的经典实验 ：肺炎双球菌的转化实验噬菌体的感染实验烟草花叶病毒的拆开与重组实验,肺炎双球菌的转化实验,噬菌体的感染实验,1952 年侯喜(A. Hershey)和蔡斯(M. Chase)利用示踪元素，对大肠杆菌 T2 噬菌体进行
5、了这类实验。 先用含有 35S 和 32P 两种元素的培养基培养大肠杆菌，然后让 T2 噬菌体侵染培养后的大肠杆菌，从而使 T2 噬菌体打上 35S 和 32P 的标记。 让这种 T2 噬菌体侵染不含标记元素的大肠杆菌，并在 T2 噬菌体完成了吸附和侵入后， 强烈搅拌洗涤，以便使吸附在菌体外表的 T2 噬菌体蛋白质外壳脱离细胞并均匀分布，再进行离心沉淀，分别测定沉淀物和上清液中的同位素标记。结果发现，几乎全部 35S 都在上清液中，而几乎全部 32P 和细菌一起出现在沉淀物中。,烟草花叶病毒的拆开与重组实验,1956 年，美国的法朗克-康勒特(Fraenkel-Conrat)将烟草花叶病毒拆成
6、RNA(因该病毒不含DNA)和蛋白质，并分别对烟草进行感染实验；结果发现只有 RNA能感染烟草，并在感染后的寄主中分离到完整的具蛋白质外壳的烟草花叶病毒。后来他又将甲、乙两种变种的烟草花叶病毒拆开，在体外分别将甲病毒的 RNA和乙病毒的蛋白质结合，将乙病毒的RNA 和甲病毒的蛋白质结合进行重组。接着他把这些经过重组的病毒分别感染烟草。结果从寄主分离所得的病毒蛋白质均取决于相应病毒的 RNA。证明了核酸(RNA)是烟草花叶病毒的遗传物质基础。,2、遗传物质的化学组成和分子结构 遗传物质的化学组成遗传物质是核酸，核酸是以核苷酸为基本单位聚合而成的高分子化合物。 遗传物质的结构DNA 双螺旋结构 D
7、NA复制半保留复制,3、遗传物质在细胞中的存在形式 真核生物真核微生物的细胞核内DNA与组蛋白结合在一起构成染色体，外有核膜包围。 原核生物细胞中有环状染色体，DNA不与组蛋白结合，无核膜包被染色体。 质粒细胞中非核染色体。质粒的存在并非微生物生命活动必需。不同类型的质粒其拷贝数各异。质粒DNA分子常呈现三种形态；常见的一种是共价、闭环状DNA(CCC DNA)；其次是由于条链有缺口而产生的开环DNA(ocDNA)；第三种是由双环分子两段均断裂而产生的线性DNA。,二、微生物菌种选育的基本方法,优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键。 理想的工业发酵菌种应符合以下要求： 遗传性状稳定； 生长快
8、，不易被污染； 产量尽可能接近理论转化率； 胞外产物； 产物类似物少； 培养基成分简单； 对环境因素不敏感； 对溶氧要求低。,菌种选育的方法：以基因突变为理论基础：自然选育（自然变异）诱变育种（人工诱导）以基因重组为理论基础：体内重组 原生质体融合、杂交、转导等体外重组 基因工程,（一）自然选育在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，从而选育出优良菌种的过程，叫做自然选育。 1、自然选育的目的保持优良性状的稳定性，减少变异或降低变异退化速度，保持菌种纯度。2、适应条件菌种长期保存前人工诱变选育高产优良菌株时用其他方法进行菌种选育时,3、自然选育的步骤表现形态目的代谢产物产量遗传基因型
9、纯度传代稳定性,从自然界中分离筛选菌种的方法步骤,（二）诱变育种诱变育种是指用人工的方法处理微生物，使它们发生突变，再从中筛选出符合要求的突变菌株，供生产和科学实验用。诱变育种与其他育种方法相比，具有操作简便、速度快和收效大的优点，至今仍是一种重要的、广泛应用的微生物育种方法。,1、突变 突变更多地是指基因突变。 基因突变的类型：点突变、染色体畸变,碱基对的置换,碱基对的置换可分成两个亚类：一类是DNA 链上的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换，称为转换；另一类是DNA 链上的一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换，称为颠换 A：T T：A A TC：G G：C C
10、 G双链DNA 单链DNA （实线代表转换，虚线代表颠换）,移码突变,移码突变 这是指由一种诱变剂而引起DNA 分子中的一个或少数几个碱基插入或缺失，从而使该部位后面全部遗传密码发生转录错误的一类突变。吖啶类染料及其化合物是移码突变的有效诱变剂，例如三氨基吖啶，吖啶黄，吖啶橙，5-氨基吖啶。吖啶类化合物的诱变机制目前还不很清楚。现普遍认为，由于吖啶类化合物是一种平面型三环分子结构，与一个嘌呤:嘧啶碱基对相似，因此能够嵌入两个相邻的DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开，从而在DNA 复制过程中，会使链上插入或缺失一个碱基，结果引起移码突变。,染色体畸变,染色体畸变是指由诱变剂引起DNA 分子的
11、大损伤，它包括染色体结构上的缺失、重复、易位及倒位等。紫外线、X 射线、射线等射线及亚硝酸、烷化剂等均能引起染色体畸变，尤其是紫外线能引起DNA 分子多处较大的损伤。紫外线主要通过在同链DNA 相邻的嘧啶间或在互补双链间形成以共价键结合的胸腺嘧啶二聚体，微生物能以多种方式去修复被紫外线损作后的 DNA，主要方式有两种：（1）光复活作用。 由于微生物中一般都存在着光复合作用，因此，用紫外线照射菌液时都须在红光下进行操作处理微生物，而后在暗室或用黑布包起来培养。（2） 暗修复作用。也称切除修复作用。X 射线和 射线为电离辐射，含有很高的能量，能产生电离作用，因而能直接或间接地改变DNA 结构。直接
12、的效应是碱基的化学键，脱氧核糖的化学键和糖酸相连接的化学键断裂；,2、诱变的基本原理诱变剂 物理诱变剂 紫外线、X射线、射线，快中子；化学诱变剂 亚硝酸、烷化剂生物诱变剂 噬菌体,诱变机理物理诱变剂 紫外线：形成胸腺嘧啶二聚体化学诱变剂 碱基突变、染色体畸变, 诱变育种步骤 出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选,确定出发菌株 菌种的纯化选优出发菌株的性能鉴定 同步培养 制备单细胞（或单孢子）悬液活菌浓度测定 诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验 诱变处理 平板分离计形态变异的菌落数，计算突变率 挑取疑似突变菌落纯培养 突变体的初步筛选用简单快捷的方法 重复筛选摇瓶发酵试验 选
13、出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理）,出发菌株的选择 1、自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。 2、在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。 3、每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。 4、出发菌株开始时可以同时选23株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。 5、要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。 6、根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用
14、于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。,处理菌悬液的制备这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。,诱变处理根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。,中间培养由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。处理方法：让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异
15、就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。,分离和筛选筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异.例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。下面介绍两类特殊菌株的筛选
16、。营养缺陷型与抗性突变株,营养缺陷型的选育,营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。与营养缺陷型对应的是野生型。营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。要研究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。,筛选营养缺陷型的步骤,诱变淘汰野生型检出缺陷型确定生长谱,淘汰野生型抗生素法：野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。差别杀菌法,
