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1、-葡萄糖苷酶研究进展1.1 问题的提出及意义随着能源危机、食物短缺、环境污染等问题正日益严重地困扰着整个世界，寻找开发新能源、 节省粮食、 减少环境污染显得越来越重要。纤维素类物质是自然界中存在的最廉价、 最丰富的一类可再生资源。 全世界每年的植物体生成量高达100-500亿吨干物质，其中一半以上为纤维素和半纤维素1。纤维素在一定条件下可以被水解成单糖， 单糖可再通过微生物发酵生产各种有用的产品，如饲料、燃料、化工原料、食品、药品等，并且可取代目前的淀粉原料发酵生产的各种产品，以及由化工燃料合成生产的部分有机产品2,3。开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术， 利用工农业废弃物等发酵生
2、产人类急需的燃料、饲料及化工产品， 即化工原料的“绿色化”，具有极其重要的意义和光明的发展前景。纤维素酶是一类能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，它是一类复杂的复合物，称之为纤维素酶系,根据其中各酶功能的差异，可将其分为三大类：(1)内切 - 1，4- 葡聚糖酶 (endo- - 1, 4- glucanase ，EC3.2.1.4，也称Cx 酶)，作用于纤维素分子内部的非结晶区或羧甲基纤维素，随机水解 - 1 ，4 - 糖苷键，将长链纤维分子截断，产生大量小分子纤维素；(2)外切 - 1，4- 葡聚糖酶 (exo- - 1, 4- glucanase ，EC3.2.1.91，也称C1 酶)，
3、作用于纤维素线状分子末端，水解 - 1 , 4 - 糖苷键，每次从纤维素链的非还原端切下一个纤维二糖分子，可以水解微晶纤维素； (3)-葡萄糖苷酶 (cellobiohydrolase,EC2.1.21，简称CBH)，水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖4。3种酶协同作用，完成对纤维素的降解。1837年，Liebig 和 Wohler 首次在苦杏仁中发现 -葡萄糖苷酶5。后来研究发现， -葡萄糖苷酶存在于植物6、昆虫7、酵母、曲霉及细菌体内。它参与生物体的糖代谢， 对维持生物体正常生理功能起着重要作用。 -葡萄糖苷酶是纤维素酶系的重要成员， 在纤维素水解时， 纤维二糖的积累会抑制内切葡聚糖酶
4、、外切葡聚糖酶的活性， 而纤维素酶组分中该酶含量最少、活力普遍较低， 因此成为纤维素酶解的瓶颈8。增加 -葡萄糖苷酶活性，会有效提高纤维素酶解效率。目前，国内外多家研究机构正致力于 -葡萄糖苷酶的分子生物学研究，以期望更好改善纤维素酶的催化效率，利用纤维素资源。1.2 国内外研究现状目前 -葡萄糖苷酶的研究主要集中在高效产生菌分离、酶作用机理、酶生理生化特性及 -葡萄糖苷酶基因克隆上。1.2.1 -葡萄糖苷酶的分类与底物特异性根据氨基酸序列分类，将 -葡萄糖苷酶划分在糖苷水解酶家族1和3中。家族1中的 -葡萄糖苷酶来自于细菌、植物和哺乳动物；家族3中的酶来自于真菌、细菌和植物。家族 l中的酶除
5、有葡萄糖苷酶活性外，还有很强的半乳糖苷酶活性9。几乎所有的 -葡萄糖苷酶对底物的糖基部分结构的专一性较差。能裂解 C0糖苷键、 CS键、CN键、CF键等；有些对糖基部分的 C和C构形也不专一，能同时水解 -葡萄糖苷酶键和 -半乳糖苷键，有些甚至 C位的专一性也不高，能水解木糖10。但在所有底物中， -葡萄糖苷酶对纤维二糖的活性最强。在 -葡萄糖苷酶 C端的高度保守序列可能与结合糖苷底物有关，在这区段的微小差异决定了 -葡萄糖苷酶的不同底物特异性11。1.2.2 - 葡萄糖苷酶的理化性质12,13,14一般来说，不同来源的 -葡萄糖苷酶的相对分子量由于其结构和组成不同而差异很大，最适 pH相差不
6、多，最适温度因其来源不同而相差很大，表一15列举了一些不同来源的 -葡萄糖苷酶的理化性质。表一不同来源的 -葡萄糖苷酶的理化性质 -葡萄糖苷酶的相对分子量一般在40250kDa之间。已报导的 -葡萄糖苷酶的pI 大多数都在酸性范围， 并且变化不大， 一般在 3.55.5 之间，但最适 pH 可以超过 7.0，而且酸碱耐受性强。 - 葡萄糖苷酶的最适温度在4 01 1 0 之间都有分布；一般来说，来自植物的 -葡萄糖苷酶最适温度在 40左右，而来自古细菌的 -葡萄糖苷酶其热稳定性和最适温度要高于普通微生物来源的 -葡萄糖苷酶16。对于工业应用来说，酶的热稳定性越高越有利。因此，从嗜热细菌中分离
7、-葡萄糖苷酶引起了人们的兴趣。1.2.3 - 葡萄糖苷酶的结构及催化机制随着越来越多的 -葡萄糖苷酶基因已被克隆和序列分析，为其基因结构与功能方面的研究提供了重要依据。同其他纤维素酶一样， -葡萄糖苷酶也具有纤维素酶的一般结构，即含有催化结构域（ CD）、结合结构域 (CBD)、连接肽 (Linker peptide)。催化结构域含有进行催化作用的活性中心， 体现了催化活性及对特定水溶性底物的特异性；CBD通常位于酶蛋白的 C-末端或 N-末端 , 其主要功能是将酶分子连接到纤维素上；连接桥主要是保持 CD和CBD之间的距离 , 也可能有助于不同酶分子间形成较为稳定的聚集体17,18。国外通过
8、 X射线晶体衍生法分析 -葡萄糖苷酶三维空间结构。糖苷水解酶家族1的典型结构具有 8个(ag)结构围成的桶状结构，也被称为47超家族。糖苷水解酶家族 3有A区和B区两个域构成， B区包括 SDW序列，内有活性为点 Asp(D)残基。在分子水平上，水解酶家族3的编码基因有 5个典型的区域构成， N端区、N端催化区、非同源区、 C端未知功能区、 C端残基19。多数 -葡萄糖苷酶中起催化作用的是两个谷氨基酸残基，其中，靠近N端的谷氨酸起酸 /碱作用，另一谷氨基酸起亲核试剂的作用20。但Grabnitz等人21研究发现来自 Clostridium thermocellum的 -葡萄糖苷酶的活性部分在
9、N端的130个氨基酸区域，该区的个性特征是氨基酸序列中心基团His-Asn-Glu-Pro，存在于该区域的具有催化作用的残基是相隔3555个氨基酸的 His和Glu， 其中质子化态的完全保持残基 His l21作为质子供体与 Glu166协同稳定氧碳正离子。 高度保守的 C-端附近的残基也许参与了酶与糖苷基底物的键合，其中在该区的一些微小差异与不同 -葡萄糖苷酶的底物特异性有关。Shoseyov ，O 等22通过用2-脱氧-2-氟基- -D-糖基氟化物对该酶活性部位亲核体鉴定发现：bgl1 氨基酸序列排布中 Asp 261 完全保守，此完全保守性与催化亲核体的关键作用完全一致。除了可形成共价糖
10、基化酶中间体和稳定氧化卡宾体的类离子过渡态外，亲核体还可调节酸/碱催化碱基的电离状态，并且过渡态中还在糖状物的2-羟基位置上形成很强的氢键。经研究证明 -葡萄糖苷酶在催化糖苷键的裂解反应时遵循两步双取代反应机制23,24，其中有两个关键的活性部位羧基参与。其反应方程式如下：第一步是酶与底物键合形成米氏复合物ES （反应速率常数分别为 K1和K1） 。第二步是酶底物中间体（E-S）的形成（反应速率常数为 K2）：酶的一个羧基（亲核体）攻击底物的端基异构体的中心部位，而另一个羧基（酸、碱催化剂）则使糖苷中的氧质子化，因此可辅助苷元的脱离，从而形成共价的 -糖基酶中间体（ E-S）。在此过程中， B
11、GL的活性中心可根据不同类型的底物而相应地发生一定程度的结构变化，从而使BGL 可以和多种糖类底物结合，这一步决定了BGL 具有底物专一性。第三步是中间体的水解，由水按碱催化机制对端基异构体进攻，形成 -糖基产物并使酶恢复其初始的质子化态。BGL 在整个反应过程中其构型保持不变。1.2.3 -葡萄糖苷酶基因的克隆与表达目前，国内外对 -葡萄糖苷酶分子方面的研究主要是：用基因工程技术构建含 -葡萄糖苷酶基因的克隆菌株；表达具有较高酶活力的 -葡萄糖苷酶；通过分子演化和设计来提高酶的功能性。 -葡萄糖苷酶基因重组表达是当前 -葡萄糖苷酶研究热点之一， 已有很多不同来源的 -葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌
12、或酵母菌中得到高效表达，见表二25。表二部分已表达克隆的 -葡萄糖苷酶基因1.2.3.1 -葡萄糖苷酶基因的克隆到目前为止，有上百个微生物、 植物和动物中的 -葡萄糖苷酶基因已得到克隆并被测序，其中以微生物和植物为主。 Pranita Roy 等26将Pichia etchellsii 的 -葡萄糖苷酶的基因进行克隆、 测序并将其在大肠杆菌中表达， 分析得到开放阅读框1515 bp，预测编码蛋白质量 54 kDa，将表达后的酶液进行 SDS-PAGE，结果证明蛋白质量为 52.1 kDa。李远华等27将与萜烯类香气前体及与抗病虫害有密切关系的茶树 -葡萄糖苷酶 cDNA通过pET-32a表达载
13、体构建的重组质粒，转化到Escherichia coli BL21zztrxB(DE3) 中表达，诱导产生了 63kD的融合蛋白， 并主要在细胞质中以可溶性蛋白形式存在。融合蛋白具有正常的生物学活性，能催化葡萄糖苷键的水解反应。早期 -葡萄糖苷酶基因的克隆是通过构建总DNA文库或鸟枪法进行活性筛选的方式获得的。随着 PCR技术的应用，可根据种属相似性进行扩增克隆得到 -葡萄糖苷酶基因。随着基因组学的发展， 越来越多的微生物基因组全序列被测定。通过序列筛查定位分析出可能的 -葡萄糖苷酶基因，是获得 -葡萄糖苷酶新基因的有效手段。近年来，热稳定性的 -葡萄糖苷酶成为研究热点，Jiong Hong和
14、Hisanori Tama28于2007年从一株嗜热子囊菌中分离出耐热的 -葡萄糖苷酶，该酶在 70高温下仍有活性，序列分析表明该酶属于水解酶家族3成员。1.2.3.2 -葡萄糖苷酶基因的表达 - 葡萄糖苷酶在纤维素降解中起关键作用，但其含量少、活力低，成为纤维素酶解的瓶颈。因此，通过基因重组技术构建工程菌，分泌表达高活性 -葡萄糖苷酶对纤维素有效降解具有重要意义。为此，已经有很多种 -葡萄糖苷酶基因被构建到不同的工程菌中。许多研究表明， -葡萄糖苷酶基因可以在大肠杆菌中表达。大肠杆菌基因结构简单，易于进行基因操作，而且它生长迅速，周期短，营养需求简单，适于工业化生产，但是，缺少真核生物的翻译
15、后加工过程。赵云，刘伟丰等29将多粘芽孢杆菌 -葡萄糖苷酶基因重组到 E.coli BL21中，在培养液中表达的 -葡萄糖苷酶活性达到 24.7IU/mL。Mi-Ri Hong ， Yeong-Su Kim等30在2009年将嗜热菌Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903的 -葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中进行表达，纯化后，比酶活达到到13 U/mg，最适 pH为5.5、最适温度为 70。随着真核表达体系的建立与完善，根据近年来研究表明， -葡萄糖苷酶基因在酵母中表达比在大肠杆菌中表达的表达量和酶活性普遍要高些。最近10年，许多细菌和真菌的 -葡萄
16、糖苷酶基因已经在酵母菌中成功地克隆和表达。酵母表达系统兼有大肠杆菌表达系统的优势：既便于培养，便于基因操作，成本低，繁殖快，又可对真核基因产物进行翻译后加工，得到正确折叠、有活性的蛋白。2003年，Kawai R和Yoshida M等人31从Phanerochaete chrysosporium 中克隆到的 -葡萄糖苷酶基因， 采用毕赤酵母表达系统进行表达，其重组表达的酶活甚至达到原始菌株几十倍。 Patrick Murraya 等32将来源于耐热真菌 Talaromyces emersonii 的属于耐热家族 3中的 -葡萄糖苷酶基因在绿色木霉中进行表达，最适温度达71.5。夏永振等33，利用酵母的表面表达系统将来自Tri
