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1、DNA体外重组技术,重组DNA技术的发展史,孕育阶段 1869年，Miescher,核素(chromatin) 1928年，Griffith, 发现转化现象 1944年，Avery，肺炎双球菌 1952年，Hershey&Chase,噬菌体肺炎双球菌: 天然感受态细菌,重组DNA理论和技术准备,1953年，Watson & Crick,DNA双螺旋 1958年，Meselson & Stahl，半保留复制 1961年, Jacob & Monod，乳糖操纵子 1961-66年，Nirenberg & Crick，遗传密码 1970年，Smith ，限制性核酸内切酶 1972年，Mertz-Da
2、vis，连接酶,重组DNA技术的发展（1973-）,1973年,Cohen,DNA体外重组。 1975年，Bishop & Varmus 在Rous 肉瘤病毒（RSV）中发现第一个癌基因V-src，获1989年诺贝尔医学和生理学奖 1976年,简悦威（Yuet-Wai Kan）用重组DNA技术首次成功进行-地中海贫血纯合子（即胎儿水肿）的产前诊断。,1973年Cohen重组DNA实验示意图,1977年Sanger等创造了双脱氧链末端终止法测定DNA序列，同时美国Maxam和Gilbert 发明了化学裂解法。 1978年，人类基因文库建立。 1981年Cech T 和 Altman 从四膜虫中发
3、现具有催化活性RNA，称为核酶(Ribozyme) 1989年获诺贝尔化学奖。,1985年Mullis 首创PCR。1993年获诺贝尔奖 1989年经美国FDA和NIH批准， William French Anderson首次在一患严重复合免疫缺陷的四岁病儿进行腺苷脱氧酶基因导入，标志人类基因治疗的开始。 1990年，美国启动人类基因组计划中国：人、鸡、水稻、表皮葡萄球菌、 痢疾杆菌、赖氏钩端螺旋体 2000年，后基因组计划（蛋白质组计划）,Venter JC et al. (2001) The sequence of the human genome. Science 291, 130413
4、51.,International Human Genome Sequencing Consortium (2001) Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409, 860921.,DNA重组的有关概念,克隆：通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。 分子克隆：在体外对DNA分子按照既定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入合适宿主，使其在宿主中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。 分子克隆: Molecular cloning 基因克隆: Gene cloning DNA重组: DNA rec
5、ombination,基因工程(genetic engineering)： 有目的地通过分子克隆技术，人为地操作 改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。分子克隆技术是基因工程的核心,理论上的三大发现：,核酸是生物的遗传物质 证明DNA的双螺旋结构及半保留复制 DNA遗传密码的破译及遗传信息传递方式,技术上的突破：, 工具酶 载体 DNA体外重组技术的建立,基因工程的基本过程,目的基因的获取：从生物有机体的基因组中分离带有目的基因的DNA片段； 选择载体并进行处理 重组：在体外将带有目的基因的DNA片段连接到能自我复制并具有选择标志的载体分子上，形成重组分子；,将重组分子导入受体细胞（细菌）:K
6、-12 带有重组子的细菌扩增，获得大量的繁殖群体； 筛选：从大量的细胞繁殖群体中筛选出带有重组DNA分子的克隆； 分析和表达：将选出的细胞克隆的目的基因进行进一步分析并实现功能蛋白的表达。,基因工程在医药学中的应用,蛋白和多肽药物的开发与生产 疫苗的研制 基因诊断和基因治疗 重大疾病发病机理及与医学相关的基础理论的研究,工具酶,限制性核酸内切酶DNA聚合酶I逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶Taq DNA聚合酶,限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease , RE),定义：限制性核酸内切酶是细菌产生的一类能识别和切割双链DNA分子内特定碱基顺序的核酸水解酶。
7、,分类：、三大类,BamH,识别顺序一般为46个碱基，通常是回文结构（反转重复顺序），即具有180的旋转对称。,作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统,限制外源DNA,保护自身DNA。,命名：,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；,第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；,第四个字母代表株；,用罗马数字表示发现的先后次序。,HindIII: H: Haemophilus in:influenzaed: D strain III: order,型酶作用特点： 只有限制性活性，无甲基化活性； 只需Mg+作为催化反应辅助因子，无须 能精确识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，以
8、内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生DNA片段5为磷酸基，3为羟基。,类酶识别序列特点 回文结构,切口 ：平端切口、粘端切口,型酶切割dsDNA产生3种不同的切口：5突出端: EcoR 5-GAATTC-33-CTTAAG-53突出端: Pst 5-CTGCAG-33-GACGTC-5平末端: Smal 5-CCCGGG-33-GGGCCC-5,反应条件缓冲液: Mg2+ 、Na+、 K+、 BSA(明胶)、 Tris.Hcl(pH7.2-7.6)反应体积：10-50l反应温度: 370C, 30-60时间: 越短越好，小时或以上 影响内切酶正常活性的常见因素DNA样品不纯:酚、氯仿、S
9、DS甘油太高：超过缓冲液选择不当：双酶切,同裂酶（同功异源酶）:不同细菌来源的酶，能识别和切割同一位点。MboI-Sau3A: 5 GATC 3同尾酶: 产生相同粘性末端的不同来源的酶。BamHI-Sau3A: 5 GGATCC 3可变酶: 识别序列中一个或几个碱基可变BstpI: 5 GGTNACC 3,DNA连接酶（DNA Ligase）,DNA重组技术的核心步骤是DNA片段之间的体外连接。将两段DNA分子拼接起来的酶即DNA连接酶。T4 DNA LigaseE.Coli DNA Ligase,主要功能：催化两个独立双链DNA片段5-磷酸基和3-羟基之间形成磷酸二酯键；修复双链DNA中一条
10、链上的缺口。 底物：两个不同片段的双链DNA间存在互补粘性末端；一条带缺口的双链DNA分子, 两个双链DNA分子间平末端。,DNA聚合酶（DNA Polymerase）,1.DNA polymerase I （全酶，Kornberg polymerase） 至少有3种活性：53聚合酶活性：催化单核苷酸结合到DNA的3-OH末端使DNA链从53延伸；,5 3外切酶活性：能从游离的5-P末端降解双链或单链DNA成为单核苷酸。 3 5外切酶活性：能从游离的3-OH末端降解双链或单链DNA成为单核苷酸。校正活性（proof-reading）,应用 催化DNA缺口平移（nick translation）
11、反应，制备高比活DNA探针；5-3 DNA聚合酶，5-3核酸外切酶 第二cDNA链合成：类似缺口平移； 对双链DNA3突出末端进行末端标记；5-3 DNA聚合酶，3-5核酸外切酶 Sanger 测序,缺口平移标记法,2、大肠杆菌DNA聚合酶klenow片段,53聚合酶活性 3 5外切酶活性 缺失53外切酶活性 应用：全酶第2-4 Random-primer DNA labeling,随机引物标记法,Taq DNA聚合酶,Taq: Thermus aquatius YT-1strain,耐高温（95）, 最适温度， DNA-dependent DNA polymerase5-exonucleas
12、etemplate-independent terminal deoxynucleotidyl transferasereverse transcriptase (RNA-dependent DNA polymerase)Lack of 3-exonuclease activity, mispairing, gene mutation,逆转录酶 （reverse transcriptase）,依赖于RNA的DNA聚合酶，这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，产物DNA又称cDNA（complementary DNA）。 RNA-dependent DNA polymerase（non-pro
13、ofreading） 5-exoribonuclease 3-exoribonuclease (RNase H),AMV 逆转录酶 (Avian myeloblastosis virus) 禽类成骨细胞性白血病病毒,M-MLV 逆转录酶 （Moloney Murine Leukemia Virus） Moloney 小鼠白血病病毒,AMV-RT: 作用温度高更适合于二级结构复杂的,末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）:将dNTP加到DNA3羟基。 3端标记DNA探针 在载体和待克隆片段上形成同聚物尾，以利DNA重组。 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）： 催化去除DNA、RNA
14、、NTP及dNTP的5磷酸基团。 在用32P标记5末端前，去除DNA或RNA的5磷酸基； 在连接反应中，去除载体DNA片段5磷酸基，防止自身环化。,依赖于DNA的RNA聚合酶,SP6: 鼠伤寒沙门氏菌 T3、T7：大肠杆菌,作用：识别特异性启动子，转录 、制备单链RNA探针 、体外（cell-free）转录/翻译 、原核表达系统中外源基因的表达 ：BL21(DE3),常用载体,载体(Vector),定义：能在连接酶作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子,常用载体 质粒DNA、噬菌体DNA、病毒 DNA、柯斯质粒,最终主要用途：,克隆载体(cloning vector
15、)-为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体表达载体(expression vector)-为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体,、原核载体: E.Coli, B.subtilis 、酵母载体: S.Cerevisiae, S.Pichia 、杆状病毒载体:sf9, sf21 、哺乳动物细胞病毒载体: CHO, COS-7,终末宿主：,E.coli,Yeast,Insects cell,Cos-7,良好的载体应具备以下条件： 必须有自身的复制子；(Replicon) 载体分子上必须有限制性内切酶酶切位点,即多克隆位点（multicloning site,MCS），以
16、供外源DNA插入；,载体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性重组子和阴性重组子； (R, Leu-, plaque, blue/white) 载体分子必须具有足够的容量 可通过特定的方法导入宿主(氯化钙，磷酸钙，电击等) 对于表达载体还应配备与宿主细胞相适应的启动子，前导顺序，增强子，加尾信号等调控DNA元件。,原核载体,一、克隆载体 1、质粒载体：小片段DNA克隆，测序pBR322: 4.36Kb, 30s copies, Ap, Tet, 负性筛选pUC18/19: 2.69Kb, Ap, 200s copies, 正性筛选,克隆载体,Cloning vectors are DNA molecules that are used to “transport“ cloned sequences between biological hosts and the test tube. 克隆载体是能携带目的DNA片段 并将其运输入宿主细胞的DNA分子。,
