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1、鱼类细胞工程基础实验,指导老师 王敏 汤蓉 辅助研究生 尹晓燕 童娜,2,课程安排,3,4,5,动物细胞工程,动物细胞工程，是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计，进行在细胞水平上的遗传操作,从而获得新型生物。,6,动物细胞工程常用技术,动物细胞培养技术 动物细胞融合技术 单克隆抗体技术 胚胎移植技术 细胞核移植技术,7,动物细胞培养,细胞培养是指从动物活体中取出小块组织分离出细胞，在模拟机体内的生理环境条件下，进行培养，使之继续生存、生长、增殖。 原代培养 传代培养 永久细胞系,8,细胞培养在水产业的应用,鱼类病毒学：病毒的分离、鉴定以及病毒疫苗的制备 鱼类细胞毒理学：评价
2、样品的细胞毒性等 水产基础理论 鱼类免疫学 鱼类遗传学,9,本实验课的目的,培养实验的思维，提高实验技能，锻炼动手能力。掌握无菌操作，养成规范的实验室工作习惯。 为将来适应多种领域的工作打基础。,10,鱼类细胞培养的基本条件,温度温度过低时细胞生长缓慢甚至不生长。利用冷冻保藏细胞可保持细胞的原有分裂分化能力。温度过高导致细胞死亡。这主要是由酶和蛋白质所需要的最适温度决定的。适宜的温度：25(温带鱼)、30(热带鱼)、15(寒带鱼)、37 (水生哺乳动物)。,11,2. pH过酸或过碱可导致细胞死亡。这主要与蛋白质的变性和细胞膜的结构受损有关。 用 NaHCO3 和 Hepes 调节培养液的pH
3、至7.4左右。,鱼类细胞培养的基本条件,12,渗透压细胞膜调节渗透压的能力是有限的。 需用平衡盐溶液配制各种试剂。 常用的平衡盐溶液： PBS ：磷酸盐缓冲溶液 （phosphate buffered solution）D-Hanks,鱼类细胞培养的基本条件,13,营养物 细胞培养基：培养基中含有细胞增殖和生长所需要的各种物质。 常用培养基：MEM 、M199、L-15 等 动物细胞离体培养常常需要血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。 小牛血清；胎牛血清。,鱼类细胞培养的基本条件,14,支持物大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃或塑料培养瓶等作为支持物。 气
4、体交换CO2培养箱, 调节CO2的比例为5%。 去离子水/三次蒸馏水,鱼类细胞培养的基本条件,15,无菌条件体外细胞培养仅仅是对所需的细胞进行培养，但环境中（如空气）有各种其他微生物，必须对所需细胞进行无杂菌的隔离培养。无菌条件是细胞离体培养最基本的条件。,鱼类细胞培养的基本条件,超净工作台,16,实验室仪器设备,实验室条件：干燥、紫外灯 仪器设备： 高压灭菌锅: 用于高压灭菌 干燥箱: 用于干燥 超净工作台: 用于无菌操作 玻璃三蒸水器: 用于制三蒸馏水 恒温生化培养箱: 用于恒温培养细胞 倒置生物显微镜: 用于观察细胞生长 液氮罐：用于细胞长期保存,17,考核方法,实验报告（论文格式） 一
5、. 目的与意义 二. 材料与方法 三. 实验结果 四. 讨论（问题经验体会）要求：多查阅参考文献，实验中胆大心细。,18,修读要求,1无菌操作，严格规范操作； 2实验是连续性的，需要每天来观察和处理细胞； 3. 每天来做实验的时间与老师和研究生协商，各组时间要相对集中和固定。,19,实验一&二 思考题,培养基过滤后需要加哪些物质？为什么？ 为什么胰蛋白酶和培养基要过滤灭菌，不能高压灭菌 ？ 生长培养基的pH值应为多少？呈什么颜色？为什么？ 为什么要培养基中需加入L- 谷氨酰胺？ 为什么复苏细胞时，要迅速解冻？,20,实验五 染色体制备,每一物种的细胞一般都具有一定数目、形状和大小的染色体。 在
6、秋水仙素的作用下可使分裂细胞阻断在中期，此时染色体形态最典型，然后通过低渗、固定、染色等步骤，便可在显微镜下呈现出其形态。,21,一、准备细胞 接种细胞：T 75cm2 瓶子 1个 培养24 h 换10mL新鲜medium和0.1mL秋水仙素（1g/L） 培养13-15h 消化细胞，1000rpm离心，5分钟，收集沉淀细胞 加2 mL PBS混匀细胞 将细胞悬液移到T 75cm2的培养瓶内,操作步骤,22,慢慢加10mL双蒸水（4） 室温孵育10min 慢慢加10mL现配的GAA固定液（冰醋酸：甲醇1：3） 室温放置10min 移到一个离心管，1000 rpm离心，10min 弃去上清，留约
7、2mL 加3mL 新鲜固定液，轻轻混匀细胞 1000rpm离心，5min 弃去上清，留约 0.5mL,23,加0.5mL 新鲜固定液，轻轻混匀细胞，然后加4mL新鲜固定液，轻轻混匀 孵育 5分钟 1000 rpm离心，5分钟 弃去 4.8mL 上清，仅留 0.2 mL 加1-1.5mL新鲜固定液，轻轻混匀细胞沉淀 二、清洁玻片 6-8个干净的玻片，浸泡在95% 乙醇里 烘干 浸泡在冰水里至少30 min,24,三、准备玻片和染色 用滴管吸取来自于步骤1-21的细胞悬液0.2mL 滴在湿玻片上 火焰上拖动，固定2-3次 放在预热的切片烘干机上，15 min （蒸发液体） 把装有1N HCl的染色
8、缸，浸入60水浴中加热， 把玻片插入培育 10min 倾去HCl溶液 用双蒸水清洗玻片2次 空气干燥,25,将玻片浸入装有Giemsa溶液的染色缸中（现稀释的1：25） 孵育 15 min 用双蒸水冲洗玻片2-3次，除去残液 空气干燥 显微镜下观察计数,26,实验六 细胞冻存,细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。 利用冻存技术将细胞置于 -196液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。 适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。 可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运
9、送某些细胞。,27,冻存原理,细胞冻存时向培养基中加入保护剂 - 终浓度5% - 15% 的二甲基亚砜（DMSO），可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下， 细胞内水分透出，减少了冰晶形成， 从而避免细胞损伤。 采用“慢冻快融”的方法能较好地保证细胞存活。 标准冷冻速度开始为 -1 - -2/min， 当温度低于 - 25时可加速，到 - 80之后可直接投入液氮内（-196）。,28,操作步骤,冻存2个75cm2培养瓶里的细胞，取68个 1.5mL的冻存管。 如果每个冻存管需要装1 mL的细胞悬浮液，需要配68mL的冻存液。 在离心管中依次加入：DMSO 0.6mL, 生长培养基 1.8mL ，FBS 0.6mL轻吹打混匀， 立即放入冰里； 另在收集消化好的细胞的离心管里加入培养液 3mL, 轻轻吹打使细胞均匀悬浮。,29,吸取细胞悬液，轻轻加入装有冻存液的离心管内。注意从底部向上缓慢拖着滴加，边加边转动离心管，使细胞均匀分布冻存液中。将细胞悬液分装在6个冻存管中，各管加1mL。 盖上冻存管盖子，用膜封口，作好标记。 在装有异丙醇的降温盒中，放装有细胞的冻存管， 加盖后盒子放入-80过夜； 盒子转移到液氮内，进行登记。,
