二乙酰一肟检测尿素

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1、尿素的测定,简 介,尿素又称脲，是体内蛋白质分解代谢的含氮终产物，不与血浆蛋白结合，分子量仅为60，体内生成量受蛋白质摄入量，机体蛋白质分解代谢及肝脏（生成尿素的唯一器官）功能的影响。尿素是表明游泳池水受到人体污染程度的一项重要指标。,二乙酰一肟（diacetylmonoxime） 法检测尿素（urea）含量,原理：尿素与二乙酰在酸性环境中加热可缩合成红色的二嗪衍生物，颜色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰不稳定，故通常用二乙酰一肟代替，它与强酸作用，产生二乙酰。后者再与尿素反应，缩合生成红色的二嗪衍生物。,临床二乙酰一肟法,H+ 二乙酰一肟+水 二乙酰+羟胺H+ 二乙酰+尿素 二嗪化合物（粉红色

2、）,泳池二乙酰一肟法,临床二乙酰一肟法测定尿素,1 原理尿素与二乙酰一肟在酸性条件下，经镉离子（或三价铁离子）的催化产生缩合，并在氨基硫脲存在下，生成了4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。,2 试剂 21 酸性试剂：在 1 L容量瓶中加入蒸馏水约 100 mL， 然后加入浓硫酸 44 mL 及 85 %磷酸 66 mL，冷却至 室温后加入硫氨脲 80 mg，硫酸镉 2 g，溶解后用蒸馏 水稀释至 1 000 mL，贮棕色瓶中放冰箱内保存半年 不变。 22 2 %二乙酰一肟溶液：取 2 g 二乙酰肟，溶于蒸馏 水中，定容 100 mL混合均匀，即可使用。 尿素使用液：取酸

3、性试剂 90 mL加 2 %二乙酰一 肟 10 mL，混合均匀即可。,3 方法 31 定性测定：取使用液 2 mL 加入试管中，加 0.1 mL 牛奶，在电炉上快速加热至煮沸，保持沸腾 1 min，观察 颜色，用不含尿素样品做比较。正常奶颜色为淡红色， 添加尿素的牛奶反应颜色为玫红色。 32 定量测定：取5mL使用液加入0.1mL牛奶，于20 mL 的螺口试管中，加盖拧紧，于 95 水浴中反应 20 min，过 滤后，于 525 nm处测定吸光值。,4 结果由于正常牛奶中含有少量的尿素，所以正常牛奶的反应试管也是有颜色的，由于尿素含量较少，所以颜色为淡红色。尿素含量异常的牛奶，反应后颜色为玫红

4、色。两者的区别明显，在实际的质量控制中，应以正常奶做比较，来判断原料奶中尿素含量的水平，进而做出判断。,5 小结优点：灵敏度高，操作简单，适用于自动仪器分析。缺点：反应不专一，线性范围窄（150mmol/L),特异性低，试剂腐蚀性强，加热有异味释放。难以实现自动化。,游泳池水中二乙酰一肟的检测方法,常采用卫生部颁发的二乙酰一肟分光光度法(简称原法) 。,二乙酰一肟分光光度法（国标法）,1. 原理尿素与二乙酰一肟及安替比林反应呈现黄色, 在波长460 nm 处有最大吸收峰,与标准系列比较定量。,2 试剂 21 二乙酰一肟溶液(2 g/L) : 取02g二乙酰一肟 CH3COC (NOH) CH3

5、 溶于10% 乙酸中,并稀释至100 ml,保 存于棕色瓶中。 22 安替比林溶液(2 g/L) :取02g安替比林C6H5NN (CH3 )C(CH3 )CHCO溶于1 + 1硫酸中并稀释至100 ml,保 存于棕色瓶中。 23 尿素标准储备溶液(100g/ml)和尿素标准使用溶液 (10g/ml) 。 24 仪器和器材 UV - 2102C型分光光度计、沸水浴锅、25 ml棕色具塞比 色管(粗细、玻璃厚薄均匀一致) 。,3 分析步骤 31 吸取水样10ml（尿素含量在00010015mg范围内）于25ml棕色具塞试管中，另取棕色具塞试管加入尿素标准使用液0、01、03、05、07、09、1

6、1、13、15ml，并用纯水稀释至25ml。（注：显色后溶液遇光退色，故需用标色法）。 32 于上述各管加入10ml二乙酰肟溶液，混均。再加安替比林溶液20ml，混匀。 33 将上述试管在沸水浴中加热50min。取出并在流动的自来水中冷却2min。立即以纯水为对照，在460nm处，用1cm比色皿，测定各管吸光值（加热4555min，呈最深色，若再延长时间吸光值下降）。 34 以浓度对照吸光值，制备标准曲线。以水样吸光值从曲线上查出尿素含量。,4 小结,优点：操作简便、灵敏度高。缺点：线性范围窄、反应时间长、标准曲线相关系数难以达到0.1999以上，对于尿素浓度高的水样,虽可将水样稀释后进行测定

7、,但稀释倍数难以估计, 所以需反复重测 , 既费时,又浪费试剂。,二乙酰一肟分光光度法（改进）,1 原理 目前二乙酰一肟-安替比林分光光度计 1 是测定尿素的唯一标准方法, 该法存在标准曲线线性范围较窄( 011 11 5 m g /L), 吸光度偏低,反应产物不稳定, 溶液显色后遇光褪色等多种问题, 对检测结果影响较大, 为此本法参阅有关文献 2, 3 , 通过摸索, 将国标法中的标准曲线扩大, 定容体积由25 m l改为10 ml, 使线性范围变宽, 吸光度的值增大, 标准系列的稳定时间长, 结果满意, 其准确度、精密度较好, 能满足基层实验室的需要。,2 试剂 21 02二乙酰一肟溶液：

8、称取02g二乙酰一肟CH3COC：（NOH）CH3溶于10乙酸中，并稀释至100ml，保存于棕色瓶备用。 22 02安替比林溶液：称取02g安替经林（1，5二甲基2苯3吡唑酮C6H5NN（CH3）C（CH3）：CHC：O），溶于11硫酸中并用混酸稀释至100ml，棕色瓶中保存。（注：硫酸浓度大于11时，显色缓慢且操作不便。）23 尿素标准溶液：准确称取01000g尿素于小烧杯中，加少量纯水溶解后转入1000ml容量瓶中，加01ml氯仿并用纯水定容，此液每ml含01mg尿素。冷藏保存。 24 尿素标准使用溶液，准确吸取尿素标准储备溶液1000ml于100ml容量瓶中，用纯水定容，此液每ml含00

9、1mg尿素。,3 分析步骤 31取游泳池水样10 ml于25 ml比色管中。另取尿素标准使用溶液( 10g/ml) 0、025、050、100、200、300、400、500、600 ml (尿素含量为0、25、5、10、20、30、40、50、60g) ,各管加纯水至10 ml,做标准系列。 32样品及标准系列管各加入110 ml二乙酰一肟溶液,摇匀,再加入210 ml安替比林溶液,混匀后置沸水浴锅中煮沸20 min (建议同时放入同时取出,或按次序放入、取出,以保证加热时间的一致。在样品多时这点尤为重要) ,在沸水浴时轻轻盖上比色管塞,以防溶液蒸发。 33停止加热后在冷水浴(1015,冷水

10、浴水位高于比色管中溶液为佳) 中冷却2 min, 再次混匀后以纯水为对照, 在460 nm处,用1 cm 比色皿,在避免阳光直射的条件下测定吸光度。绘制标准曲线并求得样品中尿素的浓度。,4 小结用改进后的二乙酰一肟比色定量法,标准曲线线性范围较原法有了很大提高,最高浓度可以测到610 mg/L,超过610 mg/L 的水样进行一倍稀释基本上均在标准曲线线性范围以内, 并保持原法的精密度与回收率; 煮沸时间由原来的50 min缩短至20 min,消除了由于长时间煮沸造成的各管溶液体积不一致、从而导致测定结果不准确的弊端;方法的精密度、准确度好,优于原法,且符合卫生检验的要求。,国标法改进前后对照

11、表,二乙酰一肟-氨基硫脲（thiosemicarbazide）法,氨基硫脲,作用,酸性试剂中的氨基硫脲与硫酸镉可促进尿素与双乙酰结合，提高灵敏度和显色后的稳定性。,化学式,CH5N3S,结构式,H2N,N,H,C,II,S,NH2,起主要作用,2（NH2)2-C=O + 2（NH2)2-C=S-（NH2)2-C=C(NH2)2 + SO2 + S （尿素） （氨基硫脲）,反应关系式,1原理尿素在氨基硫脲存在下，与二乙酰一肟在强酸环境中加热，生成红色的二嗪衍生物。显色强度在一定范围内与尿素含量成正比。,2 试剂 21 酸性试剂 浓硫酸200ml与磷酸300ml混匀，冷至室温。加 氨基硫脲50mg

12、，硫酸镉2.0g溶解，棕色瓶冷藏至少可保存一年。 22 二乙酰一肟溶液 称取4.0g二乙酰一肟，溶解后加纯水至200ml，棕色瓶冷藏可保存半年。 23 尿素标准贮存液 准确称取0.1000g尿素，加少量纯水溶解 后，移至1000ml容量瓶中，加5滴三氯甲烷作防腐剂，用纯水定容至刻度。4保存，此溶液尿素浓度为0.1mg/ml。 24 尿素标准使用液 临用时将尿素标准贮存液稀释10倍。此溶液尿素浓度10ug/ml。,3 操作步骤 31取水样10ml于具塞标准比色管中。另取比色管8只，分别加入10ug/ml的尿素标准使用液0、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00ml，

13、各加水至约10ml。 32 每管各加酸性试剂5.0ml，2%的二乙酰一肟溶液2.0ml，加纯水至25ml。沸水浴12分钟，取出后用冷水冷却至室温。 33 以空白管调零，在540nm处，用1cm比色皿测定各管吸光值。以浓度对照吸光值，制备标准曲线。以水样的吸光值在标准曲线上查出尿素含量。,4 结果本法操作简便，溶液显色稳定，线性范围宽，试剂稳定时间长，适合平时工作中使用。,作用,作显色稳定剂。,化学式,（CH3）2CHOH,结构式,H3C,异丙醇,CH,CH3,I,OH,二乙酰一肟-异丙醇-安替比林法,1 原理 在原发的基础上，选择异丙醇作显色稳定剂对游泳池水中尿素进行测定，使标准曲线的线性范围

14、有了很大的提高，缩短了煮沸时间，方法的精密度、准确度优于原法，且符合卫生检验要求。,2 试剂 2.1 二乙酰一肟-异丙醇溶液 称取1.0g二乙酰一肟溶于1+9乙酸溶液中，并使其总量为100ml，于此溶液中加入异丙醇50ml，混匀，棕色瓶中保存。 2.2 安替比林溶液 称取0.2g安替比林溶于1+1硫酸中，并使其总量为100ml，棕色瓶中保存。 2.3 尿素标准贮备液 称取0.1000g尿素，溶于少量水后移入1000ml容量瓶中，加0.1ml氯仿并用水定容，冷藏保存，此液1.00ml含0.100mg尿素。 2.4 尿素标准使用液 吸取尿素标准贮备液10.00ml于100ml容量瓶中，以水定容，此

15、液1.00ml含10. 0ug尿素。 2.5 实验用水均为去离子水。,3 测定步骤 3.1 吸取水样10.0ml于25ml无色具塞比色管中，另取同型比色管分别加入尿素标准使用液0、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml，以水定容至25ml。 3.2 于上述各管中加入二乙酰一肟-异丙醇溶液1.50ml，混匀。再加入安替比林溶液2.00ml，混匀。 3.3 各管加塞后同时置沸水浴中加热20min，取出，在流动的自来水中冷却2min。以水为对照，于460nm处，用1cm比色皿测定各管吸光度。 3.4 计算标准系列直线回归方程，以水样吸光度代入方程，求出水样尿素含量。

16、,4 小结与标准方法比较，有遇光不退色，可用普通无色比色管操作；线性范围扩大，一般游泳池水样可不经稀释一次完成测定；沸水浴时间大大缩短，节约时间等优点。应用于游泳池水中尿素的测定，其重现性、回收率、与标准方法的对照试验，均获得满意结果。,临床与预防二乙酰一肟法的区别,3 讨论 3.1 尝试以异丙醇、异丁醇、正戊醇、丙酮、乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甲醛、正辛醇、异戊醇等十余种有机溶剂作显色稳定剂试验，结果显示：甲醛使显色无法进行；正辛醇、异戊醇水溶性差，溶液出现混浊；其余试剂均有显色稳定作用，但以异丙醇显色后最稳定，灵敏度较高，水溶性好，且为常用试剂，无毒，易购得，故选之。异丙醇的使用，弥补了标准方法 3.2 经实验，异丙醇用量在0.40.6ml/管时，空白值较低，灵敏度较高，稳定性好，故选其中间值（0.5ml/管），按此比例将其与二乙酰一肟试剂混合后加入，操作方便，且不影响二乙酰一肟试剂的稳定性。 3.3 当二乙酰一肟溶液用量为1ml/管，其浓度为10g/L与20g/L时，灵敏度较高，且两者基本相同，而当其浓度为2g/L时，灵敏度大大降低，故选其浓度为10g/L。因其与异丙醇混合后一次加入，为达二物质最佳显色量，故该混合试剂加入量为1.5ml。,