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1、现代生物实验技术原理与技术学生研讨展示,已有一原核表达载体pCR2.1、RFP蛋白编码基因、以及真核表达宿主Lentinus edodes，构建RFP在宿主中的表达载体并表达蛋白。,课题,实验思路,cut,link,Target Sequence,Origin Vector,Vector,Host,Host,transfect,Protein detected,方案流程,查找载体、宿主信息,查找基因序列,表达载体筛选,载体转染宿主,构建表达载体,设计扩增引物,转染结果筛选,蛋白表达检测,查找载体信息,pCR2.1 TOPO,TA载体,查找宿主信息,香菇（Lentinus edodes）是一种重
2、要的药食两用真菌，产量仅次于双孢菇。1998年，Sato等以香菇原生质体为材料用限制性酶介导法首次成功转化香菇，将外源基因组整合到香菇的基因组中。2001年，孙丽等采用PEG(polyethylene glycol , 聚乙二醇)介导法在我国首次建立了香菇遗传转化体系。2008年，Kuo等建立了香菇电击法遗传转化体系。2009年，喻义赣等建立了香菇根癌农杆菌介导的遗传转化研究体系。,RFP基因序列查找,Addgene,红色荧光蛋白(Red Fluorecent Protein,RFP)基因是从海葵Discoso-masp中分离出的一种新的荧光蛋白基因,其蛋白质的最大吸收光谱为583 nm，不需
3、要任何预处理便可检测到。红色荧光蛋白因其红荧光较强的组织穿透力，已被广泛用于动物、植物和酵母等真核细胞内基因表达的报告基因。,启动子序列查找,题目要求网络搜索L. edodes beta-肌动蛋白启动子和终止子，但我们没能检索到任何信息，故改用其他启动子。 在香菇中较为常用的启动子主要有两种：ras基因的启动子和gpd基因的启动子。我们选用了香菇自身的gdp强启动子，因为相比ras，gpd能更有效地驱动外源基因的表达。根据己发表的香菇gpd启动子序列(郭丽琼等2007)，选择活性最强的Lgpd1启动子，并相应设计引物。,潮霉素抗性基因序列查找,通过网络搜索我们获知： 在piggyBac-IRE
4、S-Hygromycin等质粒载体中都含有潮霉素抗性基因可通过购买或索取质粒以获取HPH序列。,插入潮霉素抗性基因原因： 在转染完成后，利用潮霉素培养基培养，筛选阳性重组子。因为外源DNA整合到染色体中概率很小，有报道表明大约1/104转染细胞能整合，因此通常需要通过一些选择性标记，如潮霉素B磷酸转移酶（HPH）、氨丙基转移酶（APH，新霉素抗性基因）等。,M13F: 5 TGT AAA ACG ACG GCC AGT M13R: 5CAG GAA ACA GCT ATG ACC PF: 5CTTCGCATAGCGGGATCATA PR: 5GTTCCCTATTATTGAGATCTTCATAG
5、AAACAGTCGGCTCCTCAAG RFPF: 5CTTGAGGAGCCGACTGTTTCTATGAAGATCTCAATAATAGGGAAC RFPR: 5CCCCTGACGAGCATCACAAAATTAATCAGGAATCCCTAGTATTTTTA HPHF: 5CCGCTCGAGATGAAAAAGCCTGAACTCACCG (Xhol) HPFR: 5GCTCTAGACTATTCCTTTGCCCTCGGAC (Xbal),引物设计合成,M13 R,M13 F,PR,PF,RFPR,HPHF,HPHR,RFPF,Xho l,Xba l,M13F与M13R为载体上的保守序列引物，后期用于鉴
6、定,准备工作,1、获取各基因序列来源材料 包括V22 CS2+ RFPce （RFP来源）、香菇基因组（Lgfp1启动子来源）、 piggyBac-IRES-Hygromycin （潮霉素抗性基因来源） 2、获取连接、转化、胶回收用试剂（盒）3、引物合成（见前页）4、其他基本仪器及材料试剂,串联原件准备,用重叠PCR方法，使用两对引物（PF/PR和RFPF/RFPR）扩增出包含启动子序列和RFP基因序列的拼接序列。（先使用pfu 酶扩增，再使用Taq 酶处理扩增产物，在两端添加A）用HPH扩增引物（HPHF/HPHR）在其载体质粒（piggyBac-IRES-Hygromycin）中扩增出两端
7、分别添加了 XhoI 和 XbaI 酶切位点的片段。,串联原件构建载体,1、TA连接（启动子+RFP基因） 2、酶切连接（ IRES-hygromycin-终止子序列片段）,IRES是内部核糖体进入位点序列（Internal ribosome entry site, IRES）能招募核糖体，继续翻译Hygromycin。,串联原件构建载体,将pCR2.1载体、重叠PCR扩增所得目的基因片段按试剂盒所给体系进行连接。 连接产物中即包含了成功将【启动子+RFP基因】元件插入pCR2.1载体的成分。再通过下一步的筛选可以得到阳性的质粒载体。,1.TA连接,TA连接筛选验证,将TA连接反应产物转化感受
8、态细胞DH5（冰浴30min，立即42热激90s，再次冰浴2-5min） 转化产物涂Amp/Kana抗性平板培养筛选，涂板前加涂IPTG & Xgal进行蓝白筛选。 待菌落长成（约37下8-12h），挑取白色菌落进行菌落PCR（引物选取M13R和PR）.选取有目的条带（约1100bp）的对应菌落进行测序，确认后返还质粒。该质粒即已成功插入了目的基因。,串联原件构建载体,HPH序列连接 双酶切选择 Xba & Xho:Buffer2/4 + BSA ( NEB ),将载体和扩增片段都进行双酶切后，凝胶电泳，胶回收目的片段，将载体 片段和目的基因片段按试剂盒要求进行连接反应，得到连接产物。,2.潮
9、霉素抗性基因插入,HPH插入筛选验证,将酶切连接反应产物转化感受态细胞DH5 （冰浴30min，立即42热激90s，再次冰浴2-5min） 转化产物涂Amp/Kana抗性平板培养筛选。 待菌落长成（约37下8-12h），挑取白色菌落进行菌落PCR（引物选取HPHF和M13F）.选取有目的条带(约1kb)的对应菌落进行测序，确认后返还质粒。该质粒即已在前面基础上又成功插入了潮霉素抗性基因。 还可进行双酶切-电泳验证。,载体转染宿主,将以上获得最终质粒转染香菇原生质体。,外源基因进入细胞主要有四种方法：电激法、磷酸钙法、脂质体介导法和病毒介导法。1）电激法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入
10、；2）磷酸钙法和3）脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；4）病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。 人工脂质体法采用阳离子脂质体，具有较高的转染效率，不但可以转染其他化学方法不易转染的细胞系，而且还能转染从寡核苷酸到人工酵母染色体不同长度的DNA，以及RNA,和蛋白质.此外，脂质体体外转染同时适用于瞬时表达和稳定表达。,载体转染宿主,脂质体介导法实验步骤： 1、取少量于25 PDB培养基中静止培养7d的香菇菌丝，用0.6 mol/L甘露醇洗涤两次后加入l mL溶壁酶溶液(质量浓度1.5 mgmL，用0.6 molL甘露醇
11、溶液配制)，于30 酶解23 h，酶解后用血球计数板对原生质体计数，稀释至l108个mL。 2、在100uL原生质体溶液中加入1.5ug构建的质粒，冰浴30 min后加入25uL 60PEG溶液，冰浴10min，随后加入0.5 mL 60PEG溶液，室温作用10 min，再加入l mL CYM再生培养基进行稀释后倒入灭菌平皿中，加入大约10 mL CYM半固体培养基，在25 培养至原生质体再生。加入含有15ugmL潮霉素的PDA培养基，25 条件下继续培养得到香菇转化子。,转染结果验证筛选,挑取转染得到的香菇转化子，转接到含有50ugmL潮霉素的PDA平板中，待菌落长满平板后，刮取菌丝采用CT
12、AB法提取基因组DNA，分别PCR扩增RFPF基因和PHP基因，进行验证。 1、阳性转化子才能在含潮霉素的培养基上生长。 2、只有整合到宿主染色体上，才能扩增出目的片段。,蛋白表达验证,蛋白表达检测： 1、荧光显微镜观察 在荧光显微镜下观察样品是否有红色荧光产生 2、Western Blot 提取总蛋白，将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，然后通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印到固相支持物上。用抗红色荧光蛋白的非标记抗体（一抗）与膜进行杂交，使抗体与靶蛋白特异性结合后，再与经辣根过氧化物标记的二抗结合，最后用ECL试剂反应，经X线片曝光、显影等一
13、系列反应，达到检测靶蛋白的目的。,【1】姚强等，海峡两岸第十届菌物学暨第三届食药菌学术研讨会，Swollenin基因香菇表达载体的构建及遗传转化研究 【2】刘岩等，食品科学，扩张蛋白Swollenin基因香菇表达载体构建及其初步转化 【3】于晓玲等，食用菌学报，香菇ras和gpd启动子的克隆与功能鉴定 【4】茱莉莎，硕士论文，结球白菜中抗寒基因的克隆及香菇表达载体的构建,参考文献,THANK YOU !,关于-actin promoter & terminator的获取,因为我们没能在网上搜索到香菇-actin启动子和终止子的相关信息，所以就换用了ras启动子。 若要用香菇-actin启动子和
14、终止子，可根据-actin在同源物种中保守的特点，针对香菇同源物的保守区设计引物，再对香菇基因组进行PCR扩增，对扩增片段进行测序，进行分析后可得到其序列信息。,载体序列,问题,1、gpd是什么基因？ gpd在香菇中编码 三磷酸甘油醛脱氢酶 是一个持家基因。 2、为什么本例中，蛋白表达不需要诱导？ 因为本例中用的启动子是香菇本身的启动子，而且是一个持家基因启动子，在正常条件下就可以表达，不需要诱导。 3、有个说法错误：本例中是用质粒载体去“转化“香菇原生质体，而不是”转染”。 转化VS转染 转化： 转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内。 转染：转染的定义是“将具生物功能
15、的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。,选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力据克隆片段大小（大选大，小选小）。如10kb选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。,
