基因芯片对癌症诊断及分类的应用

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1、Microarrays for cancer diagnosis and classification报告人：陈天翔 基因芯片对癌症诊断及分类的应用 1.肿瘤基因诊断及分类 2.基因芯片技术 3.Introduction of method of cancer diagnosis 4.research in Hematologic malignancies 5.research in Solid tumors 6.Using expression profiles in the clinic Perspective reference1.肿瘤基因诊断及分类应用与价值：1）对高危易感人群中患癌危

2、险性预测；2）可进行肿瘤的早期诊断和鉴别诊断；3）可进行肿瘤分期分级和预后判断；4）对微小病灶或转移病灶的识别；5）对治疗效果的评价和监测；6）清楚区分肿瘤亚型有助于临床治疗。1.1肿瘤基因诊断的策略1.检测肿瘤相关基因 癌基因、抑癌基因、肿瘤转移基因 2.检测肿瘤相关病毒的基因 鼻咽癌EB，宫颈癌HPV 3.检测肿瘤标志物基因或mRNA肝癌甲胎蛋白（AFP） 结肠癌癌胚抗原（CEA）（1） 肿瘤相关基因的检测已证明癌基因（特别是 ras）的激活及抗 癌基因（特别是 p53）灭活与肿瘤发生发展 有密切关系。 ras癌基因的检测 Review statistics：ras基因中最常见的点突变是第

3、12，13或61密码子突 变。90%胰腺癌，50%肠癌和30%的肺腺癌存在ras 基因 突变。突变热点K-ras第12位密码子突变（GGTTGT） 。检测方法：PCR/ASOPCR-SSCP p53基因突变主要为点突变，热点区域位于突变突变 热点在第热点在第175175、284284、273273密码子。约密码子。约50%50%以上癌症患以上癌症患 者有者有p53p53基因突变。突变后不仅自身的抑癌功能丧失基因突变。突变后不仅自身的抑癌功能丧失 ，还可中和另一个野生型等位基因产物的抑癌功能，还可中和另一个野生型等位基因产物的抑癌功能 （负显性作用）。（负显性作用）。检测方法：PCRSSCPPC

4、R测序PCRRFLPp53的检测多种病毒与肿瘤有关。迄今已发现至少150多种病毒，如鸡肉瘤病毒（RSV）、小鼠白血病病毒（MuLV）、猫肉瘤病毒（FeSV）和小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）等，均可引起动物肿瘤。但真正被证实与人类肿瘤直接相关的病毒并不多，主要有人类免疫缺陷病毒（HIV）、人类乙型、丙型肝炎病毒（HBV、HCV）、EB病毒（EBV）、人乳头瘤病毒（HPV）、人T细胞白血病病毒（HTLV）等。对这些肿瘤相关病毒基因的检测，显然将有助于肿瘤的临床诊断，并对疗效监测、预后判断等具有重要参考价值。（2） 肿瘤相关病毒的检测（3）肿瘤标志物基因的检测不少肿瘤尤其是淋巴造血系统肿瘤中，由染色体

5、易位产生的融合基因可作为其特异性标志物。临床对白血病有时单凭组织形态学和组织化学染色很难确诊， 而融合基因作为特异性标记物不仅可用于诊断，对分型、预后判断和微小转移或残留病变的检测都很有帮助。 95%慢性髓细胞性白血病患者存在异常的Ph染色体，其成因 是染色体易位使9号染色体上的原癌基因abl易位至22号染色 体的bcr基因附近，产生bcr-abl融合基因；几乎100%急性早幼粒性白血病，表现为15号染色体上的 PML基因与17号染色体上的维甲酸受体（RARa）基因连接， 形成PML-RARa融合基因。融合基因检测方法：一般采用PCR技术例如用分别位于bcr和abl基因的一对特异引物作PCR，

6、只有 当abl基因易位至bcr基因附近时才能获得扩增产物。其它的检测方法PCR结合其它技术基因芯片1.2肿瘤基因诊断经历了三个基本发展阶段 第一阶段：世纪年代，以DNA 分子杂交为基础，通过限制性片段长 度多态性性（RFLP)分析进行 第二阶段：应用PCR技术 第三阶段：应用基因芯片技术 2.基因芯片技术2.1DNA芯片技术的概念 指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量 探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然 后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得出 样品的遗传信息（基因序列及表达的信息） 由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术如显 微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片

7、作为固相支持 物，所以称为DNA芯片技术2.2DNA芯片的分类原位合成芯片 （In situ synthetic GeneChip）Affymetrix公司 DNA微阵列（DNA microarray）斯坦福大学 Patrick Brown研究小组 合成DNA芯片Affymex Inc.显微光蚀刻寡聚核苷酸合成*Synthetic Chips密度大于1000/cm2Affymetrix Inc.原位合成芯片DNA微阵列DNA微集芯片Stanford Univ. Patrick Brown显微打印头单链DNA/cDNA片段Microarray PrintingDNA微集芯片.两类DNA芯片的比较

8、内 容 原位合成芯片 DNA微集阵列 制备方式 光引导原位化学合成 收集探针、显微打印 探针类型 寡核苷酸 cDNA、基因片段，寡核苷酸等 探针长度 短，小于30nt 较长 100nt500nt或更长 最高集成度 10万40万点阵/平方厘米 1万10万点阵/ 平方厘米 专利保护 专利控制严格 无专利控制*2.3DNA芯片技术原理 大规模集成的固相杂交 基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA双链 碱基互补配对、变性和复性的原理 以大量已知序列的寡核苷酸、 cDNA或基因片段作探针，检测样 品中哪些核酸序列与其互补，然 后通过定性、定量分析得出待测 样品的基因序列及表达的信息2.4DNA芯片技术流程

9、Biological SampleAnalyze dataScannermicroarray“Hybridize”arrayer Microarray fabrication Sample preparation Molecular hybridization Detection and analysis生物战剂检测疾病及肿瘤基 因诊断分类法医学鉴定药物研究开发动植物检疫基因组研究 后基因组计划生物信息学DNA芯片DNA芯片技术的应用领域3.Introduction of method of cancer diagnosis Current cancer classification incl

10、udes more than 200 type of cancer.For the patient to receive appropriate therapy,the clinician must identify as accurate as possibile the cancer type.Disadvantage of old methods Although analysis of morphologic characteristics of biopsy specimens is still the standard diagnostic method,it gives very

11、 limited information and clearly misses much important tumor aspects shuc as rate of proliferation,capacity for invasion and metastases,and development of resistance mechanism to certain treatment agent.(无法检 测出增值率，侵袭力与转移力，对化疗的抵抗 机制等) New diagnosis method microarray The advantage of microarray is hug

12、e amount of molecular information that can be extracted and integrated to find common patterns within a group of samples.（提取整合大量分子信息来寻找共 同的模式） Otherwise,microarrays could be used in combination with other diagnostic methods to add more information about the tumor specimen by looking at thousands of

13、genes.(提供更多信息)Advantages by using microarrays 1.Classifies tumor samples into known taxonomic categories. 2.Discover new diagnostic method. 3.Identifies new subtype that correlate with treatment outcome.Revealing expression profiles for cancer diagnosis and classification Two method of data analysis

14、 Supervised method-to identify molecular signatures associated with known classes Unsupervised method -to discover new classes or subclasses.Supervised method Supervised method of analysis are used predominantly to identify the differences at molecular level between known classes (class comparison)

15、and predict to which class or subclass a new tumor sample belongs(class prediction)（对 比和预测） class comparison The purpose is to understand the differences in the gene expression that might be responsible for the differences between compared classes of tumors and,to find hints on the gene may deserve further study. (which usually incorporated into class prediction)（不同种类肿瘤所表达的基因也不同）class prediction To build a gene “pre