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1、酒饼分离出根霉的活力检测一实验目的1. 掌握根霉筛选的原理和方法。2. 了解保存的 5 株根霉的活力。二实验原理1 糖化力的测定糖化力是指 1g干曲在 30、pH 值 4.6 的条件下， 1h 水解可溶性淀粉生成的葡萄糖的毫克数，计为mg/h g-1，葡萄糖的生成量采用费林热滴定。其测定的基本原理为： 淀粉水解所生成的葡萄糖等还原性糖，可在加热及碱性条件下与费林试剂中的二价铜离子发生氧化还原反应，还原糖中的半缩醛羟基被氧化， 铜离子生成氧化亚铜的砖红色沉淀。次甲基蓝的氧化型为蓝色， 还原型为无色， 当以还原糖滴定费林试剂时， 由于次甲基蓝氧化能力较二价铜弱，还原糖先与二价铜离子反应， 待二价铜
2、全部被还原后， 过量 1 滴还原糖将次甲基蓝还原， 溶液蓝色消失以示终点。2 液化力的测定液化力定义： 1.0g干曲在 30作用 1h 能液化可溶性淀粉的毫克数表示，计为 mg/h g-1。用淀粉能与碘产生蓝色反应的特性，试样浸出液在30，pH46溶液中酶解至试液对碘的蓝紫色特征反应消失。根据所需时间计算1g绝干曲在该条件下 1h 能液化淀粉的克数，表示液化力的大小。3 根霉曲试饭实验原理利用微生物的生长发酵，将曲种接种到米饭中培养72h，24h 后取其醪液测定其还原糖含量和总酸。 还原糖采用费林试剂法， 试饭酸度采用氢氧化钠滴定法。三实验材料乙酸-乙酸钠缓冲溶液 (pH46)：称取 164g
3、 无水乙酸钠 (CH3COONa)，溶解于水，加 114ml 冰乙酸，用水稀释至1000ml。缓冲溶液的 pH 应以酸度计校正。可溶性淀粉溶液 (20g/L)：称取 100105干燥 2h 的可溶性淀粉 2g，精确至 0.001g，用水调成糊状，不断搅拌注入70ml 沸水，搅拌煮沸 2min 直至完全透明，冷却至室温，完全转移至100ml 容量瓶中并定容。此溶液现配现用。标准终点色溶液：取41ml 甲液和 4.5ml 乙液混匀。甲液：称取40.2349g氯化钴，0.4878g重铬酸钾，溶解后，蒸馏水定容至500ml。乙液：称取 0.04g铬黑T，溶解后，蒸馏水定容至100ml。碘液：称取 11
4、.0g碘、22.0g碘化钾，置于研钵中，加少量水研磨至碘完全溶解， 用水稀释定容至 500ml， 为原碘液，贮存于棕色瓶中。使用时，吸取 2 0ml，加 20.0g碘化钾，用水溶解定容至500ml，为稀碘液，贮存于棕色瓶中。萄糖标准溶液 (2.5g/L)： 称取经 103105烘干至恒重的无水葡萄糖2 5g，精确至 0.0001g，用水溶解，并定容至1000ml。此溶液需当天配制。甲基蓝指示剂 (10g/L)：称取 1.0g 次甲基蓝，加水溶解并定容至100ml。费林甲液：称取硫酸铜69.28g，加水溶解并定容至1000ml；费林乙液：称取酒石酸钾钠346g及氢氧化钠 100g，加水溶解并定容
5、至1000ml，摇匀，过滤，备用；0.1mol/L 氢氧化钠溶液； 大米：市售，要求新鲜有甜味， 无沙石，米粒均匀；酒精计：标准温度 20，分度值为 0.2； 酚酞指示液（10g/L） ： 称取酚酞 1g，溶于乙醇并稀释至100mL；恒温箱，天平，500mL 三角瓶，150mL 三角瓶，1000mL 全玻璃蒸馏器，100mL 量筒，碱式滴定管；培养箱；烧杯四实验步骤1 麸皮曲的制备称取新鲜麸皮 20g，加水 12mL 充分拌匀，润料 30min 后，装于 500mL 三角瓶中，塞好棉塞， 121灭菌 30min，排气降压，待温度降至30，重复进行二次灭菌 30min。灭菌完毕，取出摇瓶打散。将
6、分离得到的根霉斜面培养物分别接于三角瓶麸皮培养基中，28恒温培养，大约到 38-48h， 三角瓶菌丝长满培养基表面， 部分菌丝倒伏时，进行扣瓶 (翻面)。在倒放翻面时， 由于三角瓶内培养基结饼， 手拍三角瓶底部， 使饼块离三角瓶内底面约 lcm 高， 在恒温箱内继续培养至72h。 三角瓶菌种培养成熟， 菌丝己长好，将三角瓶内菌种倒入己消毒过的牛皮纸袋内，搓散后放入恒温箱内40通风干燥 12h，即得纯种干曲。用封口袋包装于4冰箱保存备用。2 酶液抽提1称取 5.0g绝干重的粉碎曲样，置于250ml 三角瓶中，加水 90ml 和 10ml、pH 4.6 的乙酸 -乙酸钠缓冲液，摇匀，在30浸泡 1
7、h(每隔 15min 搅拌 1 次)。用滤纸过滤，备用。3 糖化力的测定i3.1 糖化液的制备吸取 20g/L 可溶性淀粉溶液5ml，置于 10ml 比色管中，于 30恒温水浴中保温 10min。准确加入 1ml 酶液，立刻计时，摇匀。在30恒温糖化 1h。时间到达后，迅速加入 0.1mol/L 氢氧化钠溶液 3ml，终止酶的作用。取出，冷却，加水定容至刻度，摇匀。3.2 空白液制备吸取 20g/L 可溶性淀粉 5ml，置于 10ml 比色管中，先加入0.1mol/L 氢氧化钠溶液 3ml，然后准确加入酶液1ml，立刻计时，摇匀。在30恒温糖化 1h。取出，冷却，加水定容至刻度，摇匀。3.3
8、葡萄糖含量的测定3.3.1标定费林溶液的预滴定准确吸取费林甲、乙液各5 ml 于 250 ml 锥形瓶中，加水 30 ml，混合后置于电炉上加热至沸腾。 滴入葡萄糖标准溶液， 保持沸腾，待试液蓝色即将消失时，加入次甲基蓝指示液两滴，继续用葡萄糖标准溶液滴定至蓝色刚好消失为终点，并记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积（V） 。全部滴定操作应在3min 内完成。3.3.2费林溶液的标定准确吸取费林甲、乙液各5 ml 于 250 ml 锥形瓶中，加水 30 ml。混匀后，加入比预滴定体积（ V）少 2 ml 的葡萄糖标准溶液，置于电炉上加热至沸，加入次甲基蓝指示液两滴，保持沸腾2min，继续用葡萄糖标准溶
9、液滴定至蓝色刚好消失为终点，并记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积 （V1） 。 全部滴定操作应在3min内完成。3.3.3试样的测定吸取斐林溶液甲、 乙液各 5ml 于 250ml 三角瓶中，加水 30ml，准确加入 5ml糖化液。用滴定管加入适量的2.5g/L 葡萄糖标准溶液 (使滴定时消耗 2.5g/L 葡萄糖标准溶液在 1ml 以内)。在电炉上加热至沸 ,。加 2 滴 l次甲基蓝指示剂，并保持 2min。继续用 2.5g/L 葡萄糖标准溶液滴定至蓝色消失，记录总消耗2.5g/L葡萄糖标准溶液的体积为V2，空白试验消耗2.5g/L 葡萄糖标准溶液体积为Vo，根据公式计算糖化力值 (糖化力 =(
10、V0V2)2.5/510/1100/5)。4 液化力的测定1称取 5.0g绝干重的粉碎曲样，加水90ml，加醋酸一醋酸钠缓冲溶液10ml，在 30浸泡 1h(每隔 15min 搅拌 1 次)。用滤纸过滤，备用。取2 滴预先配好的标准终点色溶液于白瓷板空穴内，作为比较颜色的标准。 准确吸取 20g/L 可溶性淀粉溶液 5ml 及水 20ml 于三角瓶中，置于30恒温水浴中保温10min。准确吸取酶液 5ml 于上述保温淀粉溶液中，立刻计时，摇匀。以后定时取出液化液1滴于预先充满稀碘液l 滴的白瓷板空穴内。当颜色与标准终点色相同时，即为反应终点，记录所需时间t(min)，并计算液化力值 (液化力
11、=60/t0.1/0.251000) 5 纯种根霉曲的试饭试验5.1 试饭的制备1称取籼米 150g，装入 1000mL 三角烧瓶中，按加水比 (1g：1.0ml)加入应加的水量，于 103高压灭菌锅中灭菌30min。要求饭重等于米和所加水量之和，不足部分可用冷开水补足。待凉至30，拌入籼米重量 0.3的曲粉， 28培养箱中培养 72h。发酵 39h 开始测不同发酵时间的还原糖含量和总酸。在发酵完毕后，另取酒碚 100g，加 200mL 蒸馏水，蒸馏，测定酒精度。5.2 还原糖含量的测定取糖化饭10g于 150ml 三角瓶中，加蒸馏水 50ml， 0. 1MPa 压力下杀菌10 分钟，迅速冷却
12、，过滤，滤液定容至500ml2。吸取斐林溶液甲、乙液各5ml于 250ml 三角瓶中，加水 30ml，准确加入 5ml 滤液。用滴定管加入适量的2.5g/L葡萄糖标准溶液 (使滴定时消耗 2.5g/L 葡萄糖标准溶液在1ml 以内)。在电炉上加热至沸，并保持 2min。加 2 滴 l次甲基蓝指示剂。继续用2.5g/L 萄糖标准溶液滴定至蓝色消失，记录总消耗2.5g/L 葡萄糖标准溶液的体积为V3，空白试验消耗 2.5g/L 葡萄糖标准溶液体积为V4。还原糖含量计算公式如下：还原糖含量 =(V4V3)2.5/5500/10*/1000*100)。5.3 试饭酸度的测定取糖化饭10g于 150ml
13、 三角瓶中，加蒸馏水50ml，0. 1MPa 压力下杀菌10 分钟，迅速冷却，过滤，滤液定容至500ml2。吸取试样 50mL 于 150mL 烧杯中，加 2 滴 10g/L 酚酞指示液， 用 0.1moL/LNaOH 溶液滴至微红色为止， 消耗0.1mol/L 氢氧化钠标准滴定溶液的体积（V5）即为试饭酸度。5.4 酒精度的测定取酒碚 100g，将上述醪液转移入1000mL 全玻璃蒸馏器中，并用200mL 蒸馏水清洗三次，一并转入1000mL 蒸馏器中，准确馏取100mL 蒸馏液，混匀后用酒精计测定蒸馏液的酒精体积百分比浓度。五、实验结果1叶磊.小曲中优良根霉的分离筛选及产酶条件研究D. 四川:西南大学 ,2009 2肖冬光 ,邹海晏 ,郭波.根霉曲试饭糖化力检测方法的研究J.酿酒科技 ,1998 （5）:60-64.
