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1、用 Quantity One 进行定量分析的方法生物技术2009-09-06, 21:17 叶林Quantity One 是 Bio-Rad 公司的凝胶电泳图像获取、处理以及定量分析软件。功能很强大，到底多么强大在这就不说了。用处很多， 到底多么多在这也不说了，具体功能请参考Quantity One 使用说明及相关教程。下面只是Quantity One 用于 DGGE结果定量分析的一般操作方法：有下面这么一张DGGE图像，需要分析一下左边第5 条泳道的8 个条带对应的DNA 在样品中占的百分比各分别是多少。第一步：建立泳道点击菜单栏 “Lane -Auto Frame Lanes ”，一般情况
2、下Quantity One 会自动识别并建立泳道。但也有很多时候不能自动建立泳道，这就需要选择菜单栏“Lane - Frame Lanes”然后输入要建立泳道的数目，手动建立泳道。泳道建立后需要调整，在菜单栏 “Lane -Edit Frame ”中有拉伸、 旋转、移动、 添加 /删除锚点等选项，通过这些选项可以对泳道进行调整，调整后大致如下：第二步：消除泳道背景点击菜单栏 “Lane -Lane Background”跳出一个对话框，“All Lanes ”中选择第二个，然后点一下第5 条泳道， “Selected Lane”的下面会显示Selected Lan:#5(#5)，然后选择 ”
3、Lane On “ Rolling Disk Size中填一个1020 之间的数 (可以多尝试几个，看看效果)，最后点 “Done ”完成操作。第三步：建立条带点击菜单栏 “Band -Detect Bands ”打开一个对话框， 调整 Sensitivity 和 Lane Width 的数值，使每个条带都被检测到，如果条带上面显示的是一条红线，可以在“Band -Band Attributes ”的 Style 栏中选择Brackets ，使之显示为括号形式。条带建立后图像显示如下：第四步：生成报告点击菜单栏 “Report -Lane Report ”然后点一下第五条泳道，在弹出的对话框的
4、Measurements 一栏中选择Trace Qty (个人感觉选择这个比较合适，也可以选择其他的看看效果)，然后点Report，就看到了每个条带的Trace Qty 值，这个值与 DNA 的浓度呈正比，根据这个值计算百分比即可。以上仅仅是Quantity One 进行定量的简单流程，非常不具体，一些具体的参数设置及软件的其它功能请参考相关的使用说明或教程。另外，不确定上面的操作是否有不当之处，如有请多指教。需要特别说明的一点是：对于一个从复杂的环境样品中提取的DNA，经过 PCR-DGGE ，然后用Quantity One 定量，通过分析每条条带的intensity 来计算百分比，然后估计
5、原始样品中各个物种（比如细菌）的百分比，这样的做法是非常不准确的， 这种数据发paper 可能不会被接受， 因为整个过程中存在很多Bias。同理，T-RFLP也存在类似问题。Quantity One施用教程大全（转贴） 2010-11-11 09:53 1 - 内容简介凝胶电泳是每个做份子有生命的物质学的同窗天天都要打交道的基本技术。电泳然后的信息处理 与电泳本身同样重要。今朝有大量软件可以用于分析电泳结果，比较有名的比如BandScan 、 BandLeader、Sigma Gel 等等。今日要向大家介绍的是来自Bio-Rad 的 1D凝胶定量软件 Quantity One （Bio-Rad
6、 还有一个做 2D凝胶分析的软件PDQuest ）。这个软件的最新版本可以在Bio-Rad 的主页不 收费下载。今朝的最新版本是4.52 版2 - Quantity One的定量方法Quantity One 的分析功能顾名思义首要用来举行凝胶或培养皿的荧光定量分析。它的分析功能 或说分析方式首要有4 种：泳道 / 条带轨迹定量法；等高线直接定量法；菌落计数；份子量测定- - - 这三种方法中施用最为利便也是最为广泛的应该是等高线定量法（Volumn Contour ）。它经由过 程半 AUTO 描绘电泳条带的等高线边沿来得到等高线区域内部平面或物体表面的大，再将该平面或物 体表面的大乘以区域内
7、平均光疏密程度值当到条带内部总的信号量。固然这种分析方法的蠹弊显而易 见：无法同等得排除不同泳道的配景亮度；等高线的绘制处于“半AUTO ”状态，即需要人为判断作 为等高线标准的电泳条带的边沿； 最致命的是在几个电泳条带距离十分接近的时辰几乎无法绘制纯一 条带的轮廓（常出现持续的几个条带等高线相连而无法分离出独自条带的轮廓）。三种方法中个人感觉最为科学和严谨的应该是泳道/ 条带轨迹定量法（ Trace Tracking）。这种 方法施用起来步调较为繁琐， 必需经由过程泳道识别 - 电泳条带识别两个持续的步调才气举行定量。 然而这种方式的最大长处在于它可以纯粹丢弃人为主观因素举行全AUTO 定量
8、。他的定量方式为：首 先根据不同电泳条带的光疏密程度值绘制光疏密程度曲线，然后计算光疏密程度曲线下平面或物体表 面的大作为电泳条带的定量根据。大家可能会问他能不能排除泳道配景？谜底是必定的，它能够最大 程度的排除不同泳道之间的配景差异， 让各个泳道上的不同电泳条带在一条几乎不异的开始跑线上举 行相比较。 这个配景排除功能是等高线法无法做到的（等高线法也有基本的配景排除措施，但是和泳 道/ 条带轨迹定量法的配景排除不是一个等级的。等高线法只能排除同一泳道上的配景，而不能均等的排除不同泳道的配景）。另外泳道/ 条带轨迹定量法还可以联合Gauss Model Bands 对紧密相连的 电泳条带举行分
9、析，而这种条带也是等高线法无法分析的。我们这次重点学习这个方法。第三个分析功能是菌落计数（Colony Counting ）。这个功能其实很实用，可以分析蓝白筛选的 结果。但是很奇怪My computer 居然无法运行这个功能，因此无法向大家介绍了。另外 Quantity One还可以经由过程回归曲线测定份子量。下面让我们了解一下Quantity One经常使用的基本菜谱操作。- - - 打开文件：由于 Quantity One是 Bio-Rad 的硬件组成一套软件，因此Quantity One可以 AUTO 输入来自 Bio-Rad 公司的凝胶分析仪的数据。具体支持哪些硬件大家可以在 “Ed
10、it -Preference-Imagers”里面设置。如果您的实验室没有接纳Bio-Rad 的硬件设施也没瓜葛。 您只要将电泳图片用ACDSee 等程序转换为 TIF 图片格式就能够被Quantity One识别了。注重 Quantity One只支持 8 位和 16位灰度的 TIF 文件。Quantity One彷佛有一个小 bug，就是在按“ Open ”然后并没有立刻弹出资源管理器让你选择方 针文件的位置。其实你只要将鼠标在荧幕右下方点击一下，资源管理器就会乖乖弹出来了. Quantity One只能分析白的颜色配景玄色条带的电泳图。而我们正常环境下得到的一般都是玄 色配景 白的颜色条
11、带的电泳图。我们可以在“Image-Invert data中将图片颜色举行反转，然后即 可以用 Quantity One举行分析了 . 文字注解： Quantity One 提供基本的文字注解功能。您可以在您的电泳图片上记载您的分析结 果比如电泳条带的份子量、光疏密程度值、事物的量等等。这个功能可以经由过程“Edit -Text Overlay Tools ”来使成为事实。 在弹出的浮动工具栏入选择“ABC ”或“”就能够举行文字输入和画 标志线的操作。光疏密程度工具：在“ View-Plot Density”的下级菜谱中大家会见到几个和电泳条带光疏密程 度值相干的预示选项。 大家可以别离选择
12、不同的选项感受一下它们之间的不同。选择方法是点击响应 的下级菜谱比如“ Plot Cross Section ”，然后将变成带一个蓝色感慨号的鼠标移到您想懂得光疏密 程度的位置， 点击一下就会预示该处的光疏密程度相干信息。鄙人面这幅图片中我们可以看见两条黄 线交叉处的电泳条带的相干信息。 上方的一串曲线是不同泳道之间在同一平行线上的光疏密程度比率 曲线；左边是黄线交叉处地点泳道的几个电泳条带的光疏密程度漫衍环境。3D Viewer ：在“View-3D Viewer”菜谱中大家会看到一个有趣的功能叫做3D Viewer 。这个玩 意按照 Bio-Rad 的说法可以辅助鉴别几条紧密相连在一路的电
13、泳条带的漫衍环境。大家只要选择了这 个号令后鼠标就会一个“ ”型，然后将型移动到您感兴趣的位置，拖动鼠标画出一个正方形区域， 然后用鼠标双击， Quantity One 就会将这块区域按照gauss 漫衍规律渲染成一个三维模子，颇有意 思。但个人感觉这个功能噱头多于实用。4 - Quantity One的基本配景排除功能最起头的时辰我们就说过Quantity One的等高线定量模式也有一种比较基本的配景排除方法。 这个方法同样也合用于泳道/ 条带定量模式。此刻我们就来学习这个方法。基本配景排除的功能位于 “Image- Substract backgroud.”和“Image- Filter
14、Wizard.”这两个菜谱。- - Image-Filter Wizard： 这个功能是对原始图片做一些开真个加工，主如果祛除一些图片上的“斑 点”。这些斑点首要有两种类型： 一种是深色的“胡椒面”型和淡色的“食盐”型，两种斑点都可以 毫不犹豫地去除。从“ Image-Filter Wizard.”菜谱调出向导菜谱后选择“pepper”和“salt ”， 下面两个选项可以按照程序默许的选项，然后“OK ”就能够完成这第一步的降噪历程。Image-Substract backgroud：这个功能是真正对图片配景举行清理的工具（区别于 “Image- Filter Wizard.”的降噪模式）。只
15、是这种清理是一种“全局”型的清理，即它以不异的 参量对每条泳道举行配景清理。然而在清理方式上它照旧可以分成两种不同的方式：Backgroud Box ：一种是以一个局部小平面或物体表面的大为标准配景，将整张电泳图片上所有 比该区域光疏密程度值低的区域全部漂白。这种发型称为“Backgroud Box”。操作时用鼠标选中对 话框下部左侧的“ Backgroud Box”按键，然后用鼠标在电泳图片上选择一块颜色近乎配景色，色泽 比较匀称的区域， 用鼠标拖动画出一个正方形。 开释鼠标后程序就会当即对电泳图片举行降低配景的 处理；Backgroud Stripe：相对于“ Backgroud Box”来讲是一种更加智能化的处理方式。它出格合用 于梯度凝胶， 即凝胶浓度由上至下依次变化。由于梯度胶的光疏密程度值在一定距离内不断变化，因 此如果接纳“ Backgroud Box”的方法除配景就会发生偏差。Quantity One 此时提供一种随着凝胶浓 度变化而变化的除配景方式就是“Backgroud Stripe”。和“ Backgroud Box”近似，
