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1、6 种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl ）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：NH2 CH2 COOH+3H2 SO4 2CO2 +3SO2 +4H2O+NH3 (1) 2NH3 +H2 SO4 (NH4 )2 SO4 (2) (NH4 )2 SO4+2NaOH 2H2 O+Na2 SO4 +2NH3 (3) 反应（ 1） 、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入CuSO4
2、作催化剂， K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以625 即得。二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（ NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中， 双缩脲与 CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分
3、子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris 缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材1.试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa ）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用bsa 浓度 1mg/ml 的 a280 为 0.66 来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制
4、成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用 H2O 或 0.9%NaCl配制，酪蛋白用005NaOH配制。（2）双缩脲试剂：称以1.50 克硫酸铜（ CuSO4?5H2O）和 6.0 克酒石酸钾钠（ KNaC4H4O6?4H2O） ，用 500 毫升水溶解，在搅拌下加入300 毫升 10% NaOH 溶液，用水稀释到1 升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中） 。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。2.器材：可见光分光光度计、大试管15 支、旋涡混合器等。（三）操作方法1.标准曲线的测定：取12 支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6 ，0.8，1.0 毫升的标准蛋白
5、质溶液，用水补足到1 毫升，然后加入4 毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（2025）下放置30 分钟，于 540nm 处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。2、样品的测定：取23 个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过 10mg/ml 。三、 folin 酚试剂法（ lowry法）（一）实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购） ，近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方
6、法是相同的，只是加入了第二种试剂，即folin 酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。folin 酚试剂中的磷钼酸盐 磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色 （钼兰和钨兰的混合物） 。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。folin 酚试剂法最早由lowry 确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应
7、发生干扰的离子，同样容易干扰 lowry 反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris 缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。 浓度较低的尿素 （0.5% ） ，硫酸纳（1%） ，硝酸纳（1%） ，三氯乙酸（0.5% ） ，乙醇（5% ） ，乙醚（ 5%） ，丙酮（ 0.5% ）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠氢氧化钠溶液的浓度12 倍。进行测定时，加folin 酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性ph 条件下稳定，但上述还原反应只在 ph=
8、10 的情况下发生， 故当 folin 一酚试剂加到碱性的铜蛋白质溶液中时， 必须立即混匀， 以便在磷钼酸 磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5mg 。通常测定范围是20250mg 。（二）试剂与器材1.试剂（1）试剂甲：（a）10 克 Na2CO3，2 克 NaOH 和 0.25 克酒石酸钾钠 （KNaC4H4O6?4H2O） 。溶解于 500 毫升蒸馏水中。（b）0.5 克硫酸铜（ CuSO4?5H2O）溶解于 100 毫升蒸馏水中，每次使用前，将50 份（ a）与 1 份（b）混合，即为试剂甲。（2 ）试剂乙：在2 升
9、磨口回流瓶中，加入100 克钨酸钠（Na2WO4?2H2O）,25克钼酸钠（Na2MOO4?2H2O）及 700 毫升蒸馏水，再加50 毫升 85% 磷酸， 100 毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10 小时，回流结束时，加入150 克硫酸锂（ Li2SO4） ，50 毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾 15 分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至 1 升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH 滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水 1 倍，使最终的酸浓度为1n 左右。（3）标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清
10、蛋白或g 球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%NaCl溶液。2.器材（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）秒表（4）试管 16 支（三）操作方法1.标准曲线的测定：取16 支大试管， 1 支作空白， 3 支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入 0，0.1，0.2 ，0.4，0.6，0.8 ，1.0 毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml ） 。用水补足到1.0 毫升，然后每支试管加入5 毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（2025）放置 10 分钟。再逐管加入 0.5 毫升试剂乙（ folin 酚试剂），同样立即混匀。这
11、一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30 分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm 处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。注意：因 lowry 反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1 支试管加入 5毫升试剂甲后，开始计时，1 分钟后，第 2 支试管加入5 毫升试剂甲， 2 分钟后加第3 支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10 分钟，则第 1 支试管可立即加入0.5 毫升试剂乙， 1 分钟后第 2 支试管加入 0.5 毫升试剂乙， 2 分钟后加第3 支试管，余此类推。待最后一
12、支试管加完试剂后，再放置30 分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升） ，并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。folin 酚试剂法实验表管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml ）未知蛋白质0.2 0.4 0.6 （约 250mg/ml ）蒸馏水1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4 试剂甲5
13、.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 试剂乙0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 每管中蛋白质的量（mg）吸光度值（ a700 ）2.样品的测定：取1 毫升样品溶液（其中约含蛋白质20250 微克），按上述方法进行操作，取1 毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3 个试管。如上表中的8、9、10 试管。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。注意 :由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸
14、和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。四、改良的简易folin 酚试剂法（一）试剂1.试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5n NaOH 、10%Na2CO3、0.1% 酒石酸钾和0.05% 硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。2.试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8 倍。3.标准蛋白质溶液：同基本法。（二）操作步骤测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1 毫升，室温放置10 分钟后，试剂乙改为 4 毫升。在 55恒温水浴中保温5 分钟。用流动水冷却后，在660nm 下测
15、定其吸光度值。改良的快速简易法，可获得与folin 酚试剂法（即lowry 基本法）相接近的结果。五、考马斯亮兰法（bradford法）（一）实验原理双缩脲法（ biuret 法）和 folin酚试剂法（ lowry 法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976 年由 bradford 建立的考马斯亮兰法（bradford 法） ，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰 g-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置
16、（lmax） ， 由 465nm变为 595nm ，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在 595nm 下测定的吸光度值a595 ，与蛋白质浓度成正比。bradford 法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比lowry 法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg 。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 lowry 法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5 分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2 分钟即可完成，其颜色可以在1 小时内保持稳定，且在5 分钟至 20 分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像lowry 法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰lowry 法的 k+、Na+、mg2+离子、 tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、 edta 等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1
