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1、6 种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏(kjeldahl )定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下:NH2 CH2 COOH+3H2 SO4 2CO2 +3SO2 +4H2O+NH3 (1) 2NH3 +H2 SO4 (NH4 )2 SO4 (2) (NH4 )2 SO4+2NaOH 2H2 O+Na2 SO4 +2NH3 (3) 反应( 1) 、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化,可以加入CuSO4
2、作催化剂, K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以625 即得。二、双缩脲法(biuret法)(一)实验原理双缩脲( NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中, 双缩脲与 CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分
3、子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、tris 缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。(二)试剂与器材1.试剂:(1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(bsa )或标准酪蛋白,配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液,可用bsa 浓度 1mg/ml 的 a280 为 0.66 来校正其纯度。如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制
4、成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用 H2O 或 0.9%NaCl配制,酪蛋白用005NaOH配制。(2)双缩脲试剂:称以1.50 克硫酸铜( CuSO4?5H2O)和 6.0 克酒石酸钾钠( KNaC4H4O6?4H2O) ,用 500 毫升水溶解,在搅拌下加入300 毫升 10% NaOH 溶液,用水稀释到1 升,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中) 。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制。2.器材:可见光分光光度计、大试管15 支、旋涡混合器等。(三)操作方法1.标准曲线的测定:取12 支试管分两组,分别加入0,0.2,0.4,0.6 ,0.8,1.0 毫升的标准蛋白
5、质溶液,用水补足到1 毫升,然后加入4 毫升双缩脲试剂。充分摇匀后,在室温(2025)下放置30 分钟,于 540nm 处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值,以蛋白质的含量为横座标,光吸收值为纵座标绘制标准曲线。2、样品的测定:取23 个试管,用上述同样的方法,测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过 10mg/ml 。三、 folin 酚试剂法( lowry法)(一)实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法,由于其试剂乙的配制较为困难(现在已可以订购) ,近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方
6、法是相同的,只是加入了第二种试剂,即folin 酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是:在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。folin 酚试剂中的磷钼酸盐 磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深兰色 (钼兰和钨兰的混合物) 。在一定的条件下,兰色深度与蛋白的量成正比。folin 酚试剂法最早由lowry 确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,缺点是费时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。对双缩脲反应
7、发生干扰的离子,同样容易干扰 lowry 反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris 缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。 浓度较低的尿素 (0.5% ) ,硫酸纳(1%) ,硝酸纳(1%) ,三氯乙酸(0.5% ) ,乙醇(5% ) ,乙醚( 5%) ,丙酮( 0.5% )等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时,必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液,只须加浓碳酸钠氢氧化钠溶液,即可显色测定。若样品酸度较高,显色后会色浅,则必须提高碳酸钠氢氧化钠溶液的浓度12 倍。进行测定时,加folin 酚试剂时要特别小心,因为该试剂仅在酸性ph 条件下稳定,但上述还原反应只在 ph=
8、10 的情况下发生, 故当 folin 一酚试剂加到碱性的铜蛋白质溶液中时, 必须立即混匀, 以便在磷钼酸 磷钨酸试剂被破坏之前,还原反应即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5mg 。通常测定范围是20250mg 。(二)试剂与器材1.试剂(1)试剂甲:(a)10 克 Na2CO3,2 克 NaOH 和 0.25 克酒石酸钾钠 (KNaC4H4O6?4H2O) 。溶解于 500 毫升蒸馏水中。(b)0.5 克硫酸铜( CuSO4?5H2O)溶解于 100 毫升蒸馏水中,每次使用前,将50 份( a)与 1 份(b)混合,即为试剂甲。(2 )试剂乙:在2 升
9、磨口回流瓶中,加入100 克钨酸钠(Na2WO4?2H2O),25克钼酸钠(Na2MOO4?2H2O)及 700 毫升蒸馏水,再加50 毫升 85% 磷酸, 100 毫升浓盐酸,充分混合,接上回流管,以小火回流10 小时,回流结束时,加入150 克硫酸锂( Li2SO4) ,50 毫升蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾 15 分钟,以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色,须再重复滴加液体溴的步骤)。稀释至 1 升,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH 滴定,酚酞作指示剂,然后适当稀释,约加水 1 倍,使最终的酸浓度为1n 左右。(3)标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清
10、蛋白或g 球蛋白,溶于蒸馏水,浓度为250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊,可改用0.9%NaCl溶液。2.器材(1)可见光分光光度计(2)旋涡混合器(3)秒表(4)试管 16 支(三)操作方法1.标准曲线的测定:取16 支大试管, 1 支作空白, 3 支留作未知样品,其余试管分成两组,分别加入 0,0.1,0.2 ,0.4,0.6,0.8 ,1.0 毫升标准蛋白质溶液(浓度为250mg/ml ) 。用水补足到1.0 毫升,然后每支试管加入5 毫升试剂甲,在旋涡混合器上迅速混合,于室温(2025)放置 10 分钟。再逐管加入 0.5 毫升试剂乙( folin 酚试剂),同样立即混匀。这
11、一步混合速度要快,否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30 分钟,以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于700nm 处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标,吸光度值为纵座标,绘制出标准曲线。注意:因 lowry 反应的显色随时间不断加深,因此各项操作必须精确控制时间,即第1 支试管加入 5毫升试剂甲后,开始计时,1 分钟后,第 2 支试管加入5 毫升试剂甲, 2 分钟后加第3 支试管,余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10 分钟,则第 1 支试管可立即加入0.5 毫升试剂乙, 1 分钟后第 2 支试管加入 0.5 毫升试剂乙, 2 分钟后加第3 支试管,余此类推。待最后一
12、支试管加完试剂后,再放置30 分钟,然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。进行多试管操作时,为了防止出错,每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量(毫升) ,并按由左至右,由上至下的顺序,逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量(微克)和测得的吸光度值。folin 酚试剂法实验表管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 (250mg/ml )未知蛋白质0.2 0.4 0.6 (约 250mg/ml )蒸馏水1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4 试剂甲5
13、.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 试剂乙0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 每管中蛋白质的量(mg)吸光度值( a700 )2.样品的测定:取1 毫升样品溶液(其中约含蛋白质20250 微克),按上述方法进行操作,取1 毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起,同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面,再增加3 个试管。如上表中的8、9、10 试管。根据所测样品的吸光度值,在标准曲线上查出相应的蛋白质量,从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。注意 :由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸
14、和苯丙氨酸,显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度(相对于标准蛋白质)。四、改良的简易folin 酚试剂法(一)试剂1.试剂甲:碱性铜试剂溶液中,含0.5n NaOH 、10%Na2CO3、0.1% 酒石酸钾和0.05% 硫酸铜,配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后,最后加入。2.试剂乙:与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8 倍。3.标准蛋白质溶液:同基本法。(二)操作步骤测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1 毫升,室温放置10 分钟后,试剂乙改为 4 毫升。在 55恒温水浴中保温5 分钟。用流动水冷却后,在660nm 下测
15、定其吸光度值。改良的快速简易法,可获得与folin 酚试剂法(即lowry 基本法)相接近的结果。五、考马斯亮兰法(bradford法)(一)实验原理双缩脲法( biuret 法)和 folin酚试剂法( lowry 法)的明显缺点和许多限制,促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976 年由 bradford 建立的考马斯亮兰法(bradford 法) ,是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰 g-250 染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置
16、(lmax) , 由 465nm变为 595nm ,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。在 595nm 下测定的吸光度值a595 ,与蛋白质浓度成正比。bradford 法的突出优点是:(1)灵敏度高,据估计比lowry 法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1mg 。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 lowry 法要大的多。(2)测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5 分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2 分钟即可完成,其颜色可以在1 小时内保持稳定,且在5 分钟至 20 分钟之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像lowry 法那样费时和严格地控制时间。(3)干扰物质少。如干扰lowry 法的 k+、Na+、mg2+离子、 tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、 edta 等均不干扰此测定法。此法的缺点是:(1