兔自身免疫性干眼模型制作及检测

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1、兔自身免疫性干眼模型制作及检测,兔自身免疫性干眼模型,概要通过体外分离、培养兔泪腺上皮细胞和自体外周血淋巴细胞，建立二者的共培养体系。将体外激活的自体外周血淋巴细胞通过耳缘静脉注射的方法诱发自身免疫性泪腺炎。从而建立稳定的兔自身免疫性干眼模型，对干眼临床指标及泪腺细胞因子表达进行检测。,兔自身免疫性干眼模型,实验动物 ： 成年雌性新西兰白兔，体质量2.63.5kg。 实验前进行兔子临床眼科检查, 排除已患有眼部炎症和其他疾病的动物，建立正常兔眼的临床检查指标的基线水平。 饲养环境符合医学实验动物环境的要求，动物饲养房温度为 252，相对湿度 50%75%，12 小时光照昼夜循环，通风状况好。,

2、兔自身免疫性干眼模型,实验所用的主要仪器、设备及材料 ：,生物超净工作台 CO2恒温细胞培养箱 移液枪 -80超低温冰箱 倒置相差显微镜 台式离心机 裂隙灯显微镜摄像系统 离心管、枪头 PCR仪 实时定量PCR仪 流式细胞仪 流式管 超纯水装置,低温水箱 裂隙灯显微镜 恒温水浴锅 眼科手术器械 祸旋仪 高压蒸汽消毒器 电子天平 鼓风式干燥箱 磁力搅拌器 PH测量计 荧光显微镜 SY-600恒温水箱 Nylon细胞滤网,兔自身免疫性干眼模型,主要试剂及溶液配制 ： 淋巴细胞培养基（CM） RPMI1640细胞培养基 450ml 胎牛血清（FBS） 10% 青链霉素 100U/ml L-谷氨酰胺

3、2mM 2-mercaptoethano 0.5ml 泪腺上皮细胞培养基（DMEM） DMEM（1X high glucose） 450ml 胎牛血清（FBS） 10% 青链霉素 100U/ml L-谷氨酰胺 2mM,兔自身免疫性干眼模型,主要试剂及溶液配制 ： Hams液 Hams F-12 1L Hepes 10ml/L 牛血清蛋白蛋白（BSA） 100U/ml 胰蛋白酶抑制剂 50mg/L 丁酸 0.22g/L 青链霉素 100U/ml L-谷氨酰胺 2mM 亚油酸 1mg/ml 42ul 各组分充分溶解于900ml Hams F-12后调节PH值至7.4，Hams F-12定容至100

4、0ml，0.22m 滤器过滤，4冰箱保存备用。,兔自身免疫性干眼模型,主要试剂及溶液配制 ： Hanks液 Hanks Salts 1bottle Hepes 2.38g EDTA 0.76g 各组分充分溶解于900ml 超纯水后调节PH值至7.4，超纯水定容至 1000mL， 0.22m 滤器过滤，4冰箱避光保存。 混合消化酶（CDH） 胶原酶 collagenase 450unit/ml 透明质酸酶 hyyaluronidase 200unit/ml DNA酶 25unit/ml 分别称取计算好的型胶原酶和透明质酸酶，将其充分溶解于一定体积的 Hams液中，加入溶解分装好的 DNA 酶充分

5、混匀，0.22m 滤器过滤，4冰箱备用。,兔自身免疫性干眼模型,主要试剂及溶液配制 ： 10% Ficoll Ficoll 粉与 DPBS 按比例配制高压灭菌, 分装后-20C 避光保存。 实时突光定量 PCR 试剂盒 SYBR Green (Roche 491385001) PE-Anti-Human Foxp3 (Biolegend) Anti-Rabbit CD4(Mouse anti-Rabbit Monoclonal AntibodyAbD ) 淋巴细胞分离液 无 RNA 酶水（DEPC 水）,兔自身免疫性干眼模型,实验方法 ： 1、兔泪腺上皮细胞分离、纯化、培养 （1）新西兰大白兔

6、肌肉注射陆眠宁和氯胺酮（两者的比例为2:3，0.3-0.4ml/kg）进行麻醉，剪去兔左眼睫毛，将生理盐水和碘伏按1:1稀释，充分清洗术眼结膜囊，再用生理盐水清洗，以免碘伏刺激眼表，后用0.5%盐酸丁卡因滴眼液滴术眼，后用无菌手术器械将麻醉后的兔子在超净台中操作摘取兔左下泪腺, 将泪腺转移到提前配置好的装有双抗和Hams液的50ml离心管中。 （2）在细胞间超净台进行以下操作，将泪腺和少量的Hams液放入培养皿中，先剔除泪腺组织周围的血管、脂肪组织和筋膜，无菌刀将腺体切碎至约1mm1mm的组织块，用移液枪加入Hanks液后吹打吹散组织块，转移到50ml离心管中倾斜静置15min，弃掉上清。 （

7、3）然后再加入Hams液吹打均匀倾斜静置15min，小心弃掉上清，以防组织块的丢失。 （4）加入配置好的消化酶（胶原酶，透明质酸酶，DNA酶）,磁力搅拌器提前设置好温度和转速，37恒温水浴消化10min。,兔自身免疫性干眼模型,实验方法 ： 1、兔泪腺上皮细胞分离、纯化、培养 （5）取出后静置15min，弃掉上清，加入10ml Hanks液反复吹打后静置15min，弃掉上清。 （6）再加入配置好剩余的消化酶，37水浴消化30min，观察组织块的大小，可适当的增减10min。 （7）然后用Hams液浸润40m无菌细胞筛，将其置于50ml离心管上，将稀释后的混合液吹打均匀后过滤，1000rpm离心

8、6min，弃上清。 （8）加入20ml Hanks液吹打均匀，离心1000rpm，6min，弃上清，加入5ml Hams液充分混匀。 （9）提前准备质量分数为10%的Ficoll（Sigma Ficoll粉与 Hams液配制），用Hams液稀释到2%、3%、4%，从下到上依次为4%、3%、2%各5ml加入50ml离心管中，将细胞悬液缓慢加入到Ficoll液面上，进行密度梯度离心，400 rpm离心10min，上下加速度为0。,兔自身免疫性干眼模型,实验方法 ： 1、兔泪腺上皮细胞分离、纯化、培养 （10）离心后，细胞在最底层。弃上清，用PBS缓冲液洗两遍细胞，洗掉杂质和Ficoll，离心结束尽

9、可能弃干净上清。 （11）加入DMEM完全培养基（10%FBS+1%双抗+1%谷氨酰胺+DMEM基础培养基），进行细胞计数和细胞活性观察，细胞计数后取一定数量105细胞于100L PBS内吹打均匀，再加入100L的台盼蓝，显微镜下观察计数板上细胞染色情况，计录未着染的细胞百分比。 （12）将分离的泪腺上皮细胞1.5105/孔放置24孔板中于37、5% CO2、100%饱和湿度的培养箱中培养。,兔自身免疫性干眼模型,实验方法 ： 2、兔外周血淋巴细胞分离、培养 （1）将新西兰大白兔固定，兔耳中动脉碘伏消毒后用酒精棉球擦拭使其血管扩张，用提前准备的静脉采血针和采血管采血，每只兔预计抽大约20mL的

10、外周血。 （2）用提前预热的37的PBS缓冲液将外周血稀释3倍后装在50mL离心管中（每管约30ml）。 （3）将每管约30ml稀释的外周血缓慢加入到10mL淋巴细胞分离液液面上，离心2000 rpm，20min，上下加速度为0。 （4）离心后可见离心管中分三层，在上、中间层界面处有一以淋巴细胞为主的白色云雾状狭窄带，这一层细胞即为所需要，吸取收集该层淋巴细胞带放入新的50mL离心管中。 （5）加入PBS缓冲液，离心2000 rpm，10min, 弃上清，再加入PBS缓冲液离心。,兔自身免疫性干眼模型,实验方法 ： 2、兔外周血淋巴细胞分离、培养 （6）加淋巴细胞培养基（10%FBS+1%双抗

11、+1%谷氨酰胺+RPMI1640培养基+巯基乙醇），计数，进行细胞计数和细胞活性观察，细胞计数后取一定数量105细胞于100LPBS内吹打均匀，再加入100L的台盼蓝，计录未着染的细胞百分比。 （7）分别配制与泪腺上皮细胞等密度的细胞液。,兔自身免疫性干眼模型,实验方法 ： 3、建立自体细胞混合培养体系 泪腺上皮细胞培养于平底24孔板内（1.5x105个/孔），单独培养2d的泪腺上皮细胞，进行线照射（剂量为25Gy），使其失去反应能力，成为刺激细胞。 载有泪腺上皮细胞的24孔板照完射线后，每孔加入当天分离等数量的外周血淋巴细胞1.5105个，此时泪腺上皮细胞已贴壁，淋巴细胞为悬浮细胞，加入淋巴

12、细胞时候小心缓慢加入，以防吹起已贴壁的泪腺上皮细胞，建立混合培养体系，培养5天。,兔自身免疫性干眼模型,实验方法 ： 4、自身免疫干眼模型的制备 （1）实验分组：24只术前检查合格的雌性新西兰大白兔，按照随机数表法给兔子编号，分为2组即正常对照组，干眼模型组。干眼模型组为静脉回输自体激活的外周血淋巴细胞诱导的兔自身免疫性干眼。正常对照组为静脉回输与干眼模型组等体积的PBS缓冲液。 （2）干眼模型的制备：将标注好的雌性新西兰白兔固定，预先准备好输液器、5ml、10ml针管、酒精、碘伏，以及预先准备好的淋巴细胞（混合体系混合培养5天，观察发现淋巴细胞较之前体积变大，呈圆形，聚集性分布，周围可见围绕

13、的泪腺上皮细胞，用1ml枪头缓慢吹起落在底部的淋巴细胞，收集到50ml离心管中，在这个过程中在显微镜下观察进来避免吹起贴壁的泪腺上皮细胞，用PBS缓冲液将24孔板洗两遍，2000rpm离心10min，弃掉上清，再用PBS缓冲液洗一遍，之后加1ml的PBS缓冲液计数，吹散细胞，尽可能不要有细胞团块避免栓塞发生的可能，最后按照淋巴细胞2105每只兔子的数量，每只兔子1ml转移到50ml离心管中放在冰上保持细胞活性，以备使用）。,兔自身免疫性干眼模型,实验方法 ： 4、自身免疫干眼模型的制备 釆用静脉输液器，预先将PBS充满整个静脉回输装置排空空气预防空气栓塞。通过耳缘静脉回输激活的自体激活的外周血

14、淋巴细胞（2x106/ml，1ml）为干眼模型组，耳缘静脉碘伏消毒后用2ml的注射器推注1mLPBS确保液体进入静脉血管中，然后在接头处换成有细胞液的注射器，注射前保证无细胞沉淀以防栓塞，匀速推注，最后换成装有PBS的注射器，再输入1ml左右的PBS保证细胞完全进入到血管中，以防细胞丢失。静脉回输等量PBS的新西兰白兔为对照组。,兔自身免疫性干眼模型,临床指标的检测 ： 移植前和移植后2周、4 周、6 周分别进行以下临床指标的观察： 泪液分泌量实验（Schirmers实验） 将兔子固定好，在非表麻条件下，将 Schirmers 试纸条顶端放置于下穹窿结膜中外侧1/3处，检查者辅助闭合兔眼，此时

15、尽量避免兔子第三眼睑遮住角膜以及试纸条，计时1分钟后取出试纸条，记录湿润长度，试验过程中尽量避免试纸条接触角膜，以免造成角膜上皮损伤。 泪膜稳定性实验（泪膜破裂时间tear break-up time，BUT） 将兔子固定好，眼表滴10L荧光素液，检查者辅助兔眨眼 3 次，计时1分钟，检查者辅助打开上下眼睑，检查者用手持裂隙灯，在钴蓝光下观察角膜表面泪膜破裂时间以及泪河高度，重复三次取平均值。 角膜、结膜荧光素钠染色实验 将兔子固定好，复方托比卡按散瞳，等待大约十分钟，等其瞳孔完全散开后，眼表滴10L荧光素液，计时1分钟，使荧光素液均匀平铺于眼表，检查者辅助打开上下眼睑，将裂隙灯下调至钴蓝光，观察角膜、结膜的着染情况并拍照记录。,