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1、基因信息的存储、传递和表达,转录 翻译复制 DNA RNA 蛋白质逆转录,中心法则(the central dogma),转录 翻译复制 DNA RNA 蛋白质逆转录,转录 翻译复制 DNA RNA 蛋白质逆转录,转录 翻译复制 DNA RNA 蛋白质逆转录,转录 翻译复制 DNA RNA 蛋白质逆转录,主要内容DNA的生物合成 复制 RNA的生物合成 转录 蛋白质的生物合成 翻译 基因表达调控 基因重组与基因工程,DNA的生物合成(复制),第十四章,DNA的生物合成复制(replication)：以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。,复制,逆转录,本章主要内容：复制的基本规律DNA复制的
2、酶学和拓扑学变化复制的过程逆转录和其他复制方式DNA损伤(突变)与修复,复制的基本规律,第一节,半保留复制 双向复制 半不连续复制 方向性和高保真性,DNA复制的特征,一、半保留复制的实验依据和意义,DNA两条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的概念,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,原核生物： 基因组是环状DNA 只有一个复制起始点复制时，DNA
3、从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸相反的复制叉，称为双向复制。,二、双向复制,复制时双链打开，分开成两股，各自作为模板，子链沿模板延长所形成的Y字形的结构称为复制叉(replication fork) 。,在原核生物双向复制中，DNA被描述为眼睛状。为说明方便而做的图为形。,ori,oriC,真核生物： 染色体DNA有多个复制起始点。 两个起始点之间的DNA片段称为复制子(replicon)。 复制子是独立完成复制的功能单位。,真核生物多个复制起始点、复制子与复制叉,真核生物的多复制子复制电镜图,领头链 (leading strand),随从链 (lagging strand
4、),三、复制的半不连续性,顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的这股链称为领头链。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,冈崎片段： 1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到DNA复制中出现一些不连续的片段，将这些不连续的片段称为冈崎片段。 原核生物: 10002000个核苷酸 真核生物: 100200个核苷酸,半不连续复制动画,DNA复制的酶学,第二节,DNA复制的体系底物: dNTP (dATP、dGTP 、dCTP 、dTTP) 聚合酶: 依赖DNA的DN
5、A聚合酶(DNA-pol)模板: 解开成单链的DNA母链引物: 提供3-OH末端的寡核苷酸其他酶和蛋白质因子: 拓扑异构酶、解螺旋酶、单链DNA结合蛋白、引物酶、连接酶,一、复制的化学反应,(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,聚合反应的特点,DNA 新链生成需引物和模板； 新链的延长只可沿5 3方向进行 。,二、DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol,活性：1. 53 的聚合活性2. 核酸外切酶活性,1959 年获诺贝尔生理学或医学奖,奥乔亚 科恩伯格Severo Ochoa A
6、rthur Kornberg,聚合反应机理,聚合反应的特点 以单链DNA为模板 以dNTP为原料 引物提供3-OH 聚合方向为5 3 遵守碱基互补规律,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,能切除引物和突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol ,催化DNA聚合,参与DNA损伤的应急状态修复,校读、修复合成、切除引物填补空隙,功能,20,40,400,分子数/细胞,10,1,1,亚基数,+,5 外切酶活性,+,+,+, 5外切酶活性,+,+,+,5 聚合酶活性,pol III,pol II
7、,pol I,E. Coli中的DNA聚合酶,功能：校读，去除RNA引物，填补空隙，参与DNA损伤修复。,DNA-pol ,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol ,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,DNA聚合酶II (DNA-pol II)具有53的聚合酶活性。只是在无pol及pol的情况下暂时起作用。对模板的特异性不高, 参与DNA损伤的应急状态修复。,DNA聚合酶III (DNA-pol III) 是复制延长中真正起催化作用的酶。 由
8、10种亚基组成不对称的聚合体。,DNA-pol ,（二）真核生物的DNA聚合酶,DNA-pol ,起始引发，有引物酶活性。,复制的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,三、复制保真性的酶学依据,复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。 复制保真性的酶学机制： （一）DNA-pol的核酸外切酶活性和即时校读 （二）复制的保真性和碱基选择,（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和即时校读,（二）复制的保真性和碱基选择,1.
9、遵守严格的碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 3. 复制出错时DNA-pol的即时校读功能。,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制,四、复制中的分子解链及DNA 分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白,E. Coli 基因图,解螺旋酶(helicase)又称解链酶或rep蛋白 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。 每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。,单链DNA结合蛋白 (single stranded DNA binding protein, SSB),
10、在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整性。,DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase),10,8,局部解链后,拓扑是指物体或图像作弹性位移而又保持不变的性质。,解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象。,拓扑异构酶作用特点 既能水解 、又能连接磷酸二酯键 克服解链过程中的打结、缠绕现象,拓扑异构酶拓扑异构酶,分 类,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。 反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。（主要
11、）,作用机制,拓扑异构酶的作用,拓扑异构酶的作用,解旋解链酶类的作用,引物酶(primase),依赖DNA的RNA聚合酶。 可以催化游离NTP聚合。 在大肠杆菌，是dna G 基因的表达产物。 催化RNA引物的生成。,引物（primer）：是由引物酶催化生成的短链RNA，它可为DNA聚合提供3-OH末端。,五、DNA连接酶,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP（NAD+）,AMP,5,3,5,3,在复制中起接合双链中单链切口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作
12、用。是基因工程的重要工具酶之一。,DNA连接酶的功能,DNA生物合成过程,第三节,（一）复制的起始,需要解决两个问题：,1. DNA解开成单链，提供模板。,2. 合成引物，提供3-OH末端;形成引发体。,一、原核生物的DNA生物合成,GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG ,5,3,1. DNA解链,E.coli复制起始点 oriC,1 13 17 29 32 44,TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA,串联重复序列,反向重复序列,5,3,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,
13、3,5,3,5,2. 引发体和引物,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,DNA解成单链由拓扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋酶解开双链，SSB结合到单链上使其稳定。,（二）复制的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,OH 3,3,领头链的合成,随从链的合成,复制过程简图,原核细胞DNA的半不连续复制过程,复制叉的移动方向,3,5,3,5,复制的起始,DNA链的延长,DNA链终止,原核生物基因是环状
14、DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,E.coli,ori,ter,82,32,ori,ter,SV40,50,0,（三）复制的终止,随从链上不连续性片段的连接,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期,二、真核生物的DNA生物合成, 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。, 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。 复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。,（一）复制的起始,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,
