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1、,第五章 神经干细胞研究及应用前景,进入20世纪60年代，干细胞的研究得到迅速发展并取得突破性进展，2000年被Science评为年度十大成就之一。血液干细胞是研究、也是在技术方法、来源、理论和实际应用等方面取得最多成就的干细胞。继血液干细胞之后，近来对神经干细胞的研究格外重视，它对神经退行性疾病的治疗展示了诱人的前景。,第一节 干细胞的基本概念,某种细胞是不是干细胞要取决于它在体内、特定的培养条件以及被移植到不同组织后的表现。事实上，干细胞是一类相当特殊的细胞，它不仅可以自我更新，而且能最终分化成为一些特定的功能细胞。尽管机体中绝大多数细胞都是可以行使特定功能的分化细胞，干细胞却能始终保持未
2、分化状态，直到接收到能促使它发育为特定功能细胞的信号。可以说，正是由于同时具备了增殖和分化这两方面的潜能干细胞，干细胞才变得与众不同。,一、干细胞的类型按分化的潜能： 1.全能干细胞（totipotent stem cell）：即受精卵，可以分化成构成胚胎的所有组织和细胞，包括胚胎在子宫中发育的胎盘。 2.多能干细胞（pluripotent stem cell）：具有发育成内、中、外3胚层细胞的能力。尽管如此，却无法生成胚胎发育所需的全部细胞，置于子宫内无法发育成胎儿。 3.单能干细胞（unipotent stem cell）：那些只能沿某一特定路径分化的细胞，这一概念通常适用于成年有机体内那
3、些最终只能产生某一类功能细胞的干细胞。如血液干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞。,按干细胞所处的发育阶段：1.胚胎干细胞（embryonic stem cell， ES，ESC）：该类细胞来源于胚胎发育的极早期-胚泡期，准确讲是来自植入子宫以前的内细胞团细胞，它们自我复制并具有多能性，可以分化成内、中、外三个胚层的功能细胞。2.成体干细胞（adult stem cell）：是位于分化组织中的未分化细胞，一般讲，成体干细胞分裂后生成祖细胞或前体细胞。存在成体干细胞的组织包括骨髓、血液、脑、肝脏、皮肤、消化道及胰腺等。不具备多能性,二、干细胞的分化潜能有些干细胞之间似乎可以相互转化，发生所谓的横向转化
4、，神经干细胞在动物体内环境作用下转变成血细胞、肌肉干细胞可分化成造血细胞、骨髓间质干细胞经体外传代后，在特定条件下分化为神经元，少突胶质细胞的前体在特定情况下形成神经球，并可进一步生成神经元，逆分化（reprogramm）。对于CNS、胰岛、心肌等干细胞相对难以获得的组织器官，干细胞相互之间的这种横向分化能力无疑非常有益。我们可以在患者自身的皮肤、骨髓等处取干细胞，在体外创造某种环境，诱导它们生成目标细胞，然后移植回病人体内相应位置。,三、成体干细胞与胚胎干细胞的异同 （一）相似性 1.归巢现象：向受损部位迁移的趋势；细胞所处的微环境（体外培养环境还是移植的环境）对两种干细胞的分化命运均产生重
5、大的影响 2.免疫特性：在免疫性这一方面并未发现哪种干细胞（胚胎或成体）有特殊的优越性。 （二）区别 1.来源不同：尽管数目相当少，但成体干细胞的确存在于相当多的人体组织中；胚胎干细胞是否存在于大多数的胚胎组织中现在还不确定，组织培养中的胚胎干细胞都来自早期胚胎的内细胞团细胞。 2.增殖和分化能力的差异：在实验室条件下能够培养生成大量的人类ES细胞，并能在多次传代之后始终保持未分化状态；成体干细胞要做到持续增殖而不分化很难，至少现在对此还缺乏行之有效的解决办法。这一技术难题是研究者无法由特定的成体干细胞取得足够数量的功能细胞，进而使得拿不到足够数量的细胞，成为成体干细胞移植的颈瓶所在。,3.分
6、化潜能不同：胚胎干细胞的多能性现已十分明确，它们有分化成所有胚层细胞的能力；但成体干细胞却没有多能性，目前尚无证据表明，一个单一的成体干细胞能够生成许多不同类型的功能细胞。,第二节 神经组织的干细胞及其特性神经干细胞通常用于指那些具备以下特点的细胞： 1.能够生成神经组织或来源于神经系统 2.具有自我更新能力 3.可以通过不对称分裂产生更多的干细胞及一种或几种前体细胞。神经元的前体细胞分裂后可生成神经元，胶质细胞前体则可最终生成星形胶质细胞或少突胶质细胞。胚胎干细胞或成体内的神经干细胞却可依据它接收信号及所处环境的不同，而生成神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。,一、成年脑内的干细胞：是散布于
7、三处的三群细胞： 1.前脑侧脑室周围的细胞。 2.脑室向嗅球这一神经元迁移通路上的细胞。 3.海马区细胞。,1.海马区的干细胞：齿状回颗粒下层，50%分化成齿状回的颗粒细胞；15%胶质细胞，其余是形态上无法辨别种类的细胞。 2、室下区（SVZ区）的干细胞：前脑侧脑室周围的细胞,在室管膜层之下，包含有未成熟的神经元、未成熟的星形胶质细胞及一种处于快速增殖状态的细胞。SVZ区这种广泛的增殖活性提示干细胞可能就位于此区域内。在体外条件下，该区细胞在EGF或FGF-2刺激下可形成神经球，而且可以分化产生神经元或胶质细胞。 3、脑室区的细胞：室管膜细胞，具有神经干细胞的特性。 4、神经发生区之外的神经干
8、细胞：成年视神经、皮质、脊髓、中隔和纹状体,二、胎脑中的干细胞在胚胎哺乳动物脑内，神经干细胞主要集中于嗅球、侧脑室的管膜区、室下区、海马、脊髓、小脑和大脑皮质等7个部位。科学家已经实验了对来自早期胚胎的人类CNS干细胞的体外培养，在培养中这些干细胞保持未分化状态。在特定的条件下，它们可被诱导生成中枢神经系统的三种主要的细胞（即神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞）。神经嵴干细胞；胶质干细胞,第三节 神经干细胞的研究内容和方法,神经干细胞存在于胚胎神经系统和成年脑的某些特定部位。它的特点为： 1、缺乏任何特殊的形态。 2、不表达成熟神经元的各种抗原。 3、表达NSCs特征性的生物学标志-神经巢蛋白
9、（nestin）。成年神经系统中干细胞的功能还不十分明确，一般认为，它们（尤其是位于海马区的干细胞）很可能与认知功能密切相关，是神经功能可塑性的基础。具体说就是在某些外界环境影响下，干细胞在局部生成的新神经元可以参加记忆的形成和整合，即大脑的控制行为，行为又可以反过来影响大脑的结构。,目前对神经干细胞的研究主要集中于三个方面： 1.体外的研究，将NSCs在体外培养增殖，研究干细胞的定向分化。 2.NSCs的在体研究，对成年CNS干细胞增殖分化影响因素的研究。 3.移植研究。小鼠、人神经干细胞的移植研究，神经退行性疾病的治疗。,一、神经干细胞体外研究（一）NSCs的来源 1、胚胎神经组织； 2、
10、成年神经组织； 3、胚胎干细胞。 其它多能干细胞在特定条件或环境中能发生所谓所得横向分化成神经干细胞。NSCs在胚脑中广泛存在于皮质、海马、纹状体、小脑、嗅球等处。成年脑中，目前公认只有海马的齿状回和脑室的室下区。胚胎干细胞存在于胚胎发育的早期第三天囊胚的内细胞团和原始生殖细胞（primordial germ cell）。,NSCs的体外研究工作起初只限于啮齿动物，随后很多实验室致力于人神经干细胞的研究。已从胎儿脑的某些部位及成年人嗅球、海马等处成功分离了NSCs，体外培养、扩增，已有商品化的人神经组细胞的问世（human neural progenitors, HNPs）无论是从人类的受精卵
11、还是胎儿脑内分离干细胞，在伦理道德方面都有极大的争议，这种情况科学家去寻找其它的干细胞源：死后小鼠前脑的室管膜下，死后20小时人脑中提取有功能的干细胞。,（二）体外培养的一般过程源于神经组织的干细胞体外培养的一般过程为：从脑中分离特定的神经组织，酶法或机械法得到单细胞的悬液，用加有高浓度促有丝分裂原的无血清培养基刺激其中的干细胞增殖，一段时间后撤去促分裂原或将细胞暴露于其它因子中，NSCs就会发生分化，最终生成CNS内的某种功能细胞。培养细节不同，造成实验结果的不尽相同。促干细胞增殖的生长因子就有内皮生长因子（EGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）或联合应用三种方案，使用的浓度也不完全相同；
12、细胞培养则有传统的单层贴壁培养和所谓的“神经球”（neurosphere）悬浮培养两种方式。,为了使干细胞处于不断增殖分裂中，有些研究者将外源性癌基因导入NSCs中，建成了永久性的干细胞系，常用SV40的大T抗原或V-myc。这种干细胞的特点是：1、自我复制并在体外增殖大量的干细胞；2、移植人体后人保有多项分化的潜能；3、可以转染并稳定表达外源性的基因。局限性在于原癌基因的导入使细胞的基因组结构发生了改变，从而易于发生进一步突变，产生致癌性或者对细胞的分化命运发生影响。,NSC在培养的条件下必须加入白血病抑制因子（leukaemia inhibitory factor, LIF），才能保持未分
13、化状态并持续增殖，撤去LIF以后，ESC迅速分化，最终产生多种细胞系或发育成胚胎体（embryoid body, EB）。这种分化是随机的，寻找ESC分化的影响因子，从而实现其定向分化是目前研究的热点之一。许多研究者认为，NSCs是ESC分化的误入歧途（default way），也就是说ESC有自发产生神经细胞的趋势。,神经干细胞的定向分化（即由NSCs人工诱导产生分泌所需特定神经递质的神经元）主要受：（1）各种生长因子；（2）决定细胞命运的其他分子；（3）相邻细胞之间的直接交流等多种因素的影响。而且不同种属的NSCs对同一诱导因子的反应不尽相同，不能把动物实验的结果外延至人。,二、神经干细胞
14、的移植研究,所谓细胞移植是指外源性补入由病理过程造成损伤或丢失的功能细胞，从而重建器官功能的方法。理想的移植细胞应具有： （1）强大的增殖潜能，以便使来自少量供体组织的细胞能在体外培养获得大量可供移植的细胞； （2）保持未成熟特性及表型的可塑性； （3）增殖和分化的可控性。根据NSCs的特点，不难看出神经干细胞是神经系统疾病治疗的绝佳候选细胞。,Renfranz PJ从胚胎16天大鼠海马原基中分离干细胞、Suhonen JO等从成年海马分离出的干细胞研究结果提示：（1）在干细胞的分化中，干细胞所处环境而非内在特性对其分化的方向有指导意义。（2）成年哺乳动物脑中分离出的干细胞，能在体外长期培养并
15、仍能保持多项分化潜能；（3）成年动物脑内某些区域，如海马、嗅球仍保留诱导干细胞分化的信号系统，而小脑在成年后却丧失了此项功能。来自胚胎干细胞的研究也发现由ESCs诱导形成的神经前体细胞注入胚胎大鼠脑室中后，可接受脑内信号的指导，在神经系统迁移，并分化成为神经系统主要的三种细胞，其整合与分化的特性与从胚脑中取出的干细胞是一致的。,近年来，细胞移植在中枢神经系统疾病的治疗中异军突起，为某些难治性疾病的缓解开辟了一片崭新的天地。一般认为，植入细胞的功能可能有三个方面：1、释放神经递质；2、产生神经营养或保护因子；3、改变脑组织对损伤的反应，帮助结构修复。目前这一治疗方案已用于多种疾病的临床治疗中。其
16、中最成功的例子是帕金森病（Parkinsons disease ,PD），研究者从8-9周人胚中前脑部分离的细胞植入PD患者一侧的纹状体中，发现在移植后6-24周逐渐出现临床症状的改善，并可维持较长时间（5-10年）。,众所周知，在移植治疗中最棘手的问题就是免疫排斥，各种移植物抗宿主反应常使治疗功亏一篑，甚至造成严重的后果。但人所共知，由于血脑屏障的存在，脑内淋巴细胞的数量远远少于外周，对植入细胞的排斥反应相对来说也要轻的多，这就使CNS疾病的细胞移植治疗具备了一个得天独厚的优越性。,三、神经干细胞的体内研究及调控因子,利用逆转录病毒、3H标记的T（thymidine）或Brd U 可对于分裂
17、状态的细胞进行标记的特性，研究者对存在于体内的神经干细胞群进行了大量的研究，现已基本达成共识，在所有成年哺乳动物的大脑中至少有两处，即海马齿状回和SVZ区仍保有高密度的细胞分裂，而且这种能力在整个生命期间均可保持。,研究表明，大量遗传的、环境的和分子的因素能够调节成体内神经干细胞的功能状态，这种调节涉及到干细胞的增殖、迁移和分化等方方面面。目前看来，体内神经干细胞的功能状态受如下影响：（1）学习因子：“丰富环境”（enriched environment）是近年来用于观察哺乳动物海马中前体细胞增生的一个常用模型。研究表明，在丰富环境中生活一段时间后，成年大鼠海马DG神经元的净增长显著增加，空间学习能力也明显增强；（2）年龄：随着年龄的增长，神经干细胞的增长能力逐渐下降，但在老年啮齿类动物及哺乳动物中仍保有此项功能。（3）应激因素：糖皮质因素、紧张等应激因素可使中枢内的神经发生明显下降。一个确切的证据是，肾上腺切除动物的神经发生显著提高，而加入糖皮质激素该作用可被阻抑。,
