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1、微生物检验技术,1,微生物检验技术,一、环境监测 二、无菌检查 三、微生物限度检查,2,一、环境监测,无菌检查实验环境的修订修订依据及意义：2010版GMP附录一无菌药品和附录三生物制品中均规定，非最终灭菌产品各工序关键操作环境应为B级背景下的A级。无菌检查的洁净环境不得低于生产关键区的洁净环境要求！,3,一、环境监测,微生物限度检查实验环境的修订,4,一、环境监测,GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准,5,一、环境监测,药品洁净实验室监测项目及频次（参考）,6,一、环境监测,培养基 胰酪大豆胨琼脂（TSA） 细菌、酵母菌和霉菌的生长必要时可加入添加剂消除和减少消毒剂和抗生素的作用。，
2、沙氏葡萄糖琼脂(SDA)（当监测结果有疑似真菌或考虑季节因素影响时）培养时间： ChP(2015) GB/T 16293-2010TSA: 3-5天 不少于2天SDA: 5-7天 不少于5天,7,二、无菌检查,总则：环境、设备、人员 培养基：品种、制备、灭菌、贮存、适用性检查 方法适用性试验：直接接种法、薄膜过滤法 供试品的无菌检查：供试品的处理、对照试验、直接接种法、薄膜过滤法、培养及观察 结果判断,8,二、无菌检查,1.总则 1）对象： 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条
3、件下未发现微生物污染。,9,二、无菌检查,2）环境： 应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，（ 9203 药品微生物实验室质量管理指导原则:环境洁净度B 级背景下的局部A 级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中进行） 【 10版：应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行】，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。 A 级和 B 级区域的空气供给应通过终端高效空气过滤器（HEPA） 。,10,二、无菌检查,3）人员： 【10版：无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。】 15
4、版删除。,11,二、无菌检查,2、培养基,12,二、无菌检查,2.培养基 硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需气菌培养。 胰酪大豆胨液体培养基适用于真菌和需气菌的培养。 1）培养基的制备及培养条件 配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌 制备好的培养基应保存在225、避光的环境 若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。,13,二、无菌检查,2）培养基适用性检查 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。 本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。,14,二、无菌检查,2
5、）培养基适用性检查 无菌性检查: 每批培养基随机取不少于 5 支（瓶） ，置各培养基规定的温度培养 14天，应无菌生长。 灵敏度检查 菌种 试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 菌液：浓度100cfu/ml 接种：2管+菌液，1管空白 结果判断：+菌液-生长良好空白-无菌生长,15,二、无菌检查,2灵敏度检查 菌液制备: 取菌种新鲜培养物接种至相应培养基，培养。,上述培养物用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100 cfu的菌悬液。,16,二
6、、无菌检查,2培养基灵敏度检查 培养基接种:取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基7支，每管装量为9ml的胰酪大豆胨液体培养基7支,分别接种相应菌液。逐日观察结果。,结果判定: 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。,17,二、无菌检查,3.方法适用性试验（方法验证试验） 当进行产品无菌检查法时，应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。 验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。 方法适用性试验也可与供试品的无菌
7、检查同时进行 。,18,二、无菌检查,4.供试品的无菌检查 无菌检查法包括 薄膜过滤法 直接接种法 只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。 供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适用性试验确认的方法相同。 无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。,19,二、无菌检查,4.供试品的无菌检查阳性对照 应根据供试品特性选择阳性对照菌： 无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌； 抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌； 抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌； 抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。 阳性对照试验
8、的菌液制备同方法适用性试验，加菌量小于100CFU，供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量。 阳性对照管培养4872 小时应生长良好。 阴性对照 供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。,20,二、无菌检查,4.供试品的无菌检查 1. 薄膜过滤法 薄膜过滤法应采用封闭式薄膜过滤器。【10版删除：可用一般薄膜过滤器】。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45m。直径约为50mm。 根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。【10版删除：抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜。 滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。 】使用时，应保证滤膜在过滤
9、前后的完整性。,21,二、无菌检查,4.供试品的无菌检查 1. 薄膜过滤法 水溶性供试液过滤前应先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。 供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，且总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。,22,二、无菌检查,2. 直接接种法 直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品，即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。 除生物制品外，一般样品无菌检查时两种培养
10、基接种的支/瓶数相等；生物制品无菌检查时硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基接种的支/瓶数为2：1。 除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，胰酪大豆胨液体培养基每管装量不少于10ml。供试品检查时，培养基的用量和高度同方法适用性试验。,23,二、无菌检查,4.供试品的无菌检查 培养及观察 将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养14天；接种生物制品供试品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分成两等份，一份置3035培养，一份置2025培养。 培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。
11、如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14 天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，培养3 天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。,24,二、无菌检查,4.供试品的无菌检查 结果判断 阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。 若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。,25,二、无菌检查,4.供试品的无菌检查 结果判断 当符合下列至少一
12、个条件时方可判试验结果无效： （1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。 （2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。 （3）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。 试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。,26,三、微生物限度检查（微生物计数法）,1 总则：环境、要求 2 计数方法：平皿法、薄膜过滤法、最可能数法（MPN法） 3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查、
13、计数方法适用性试验、 4 供试品检查：检验量、供试品检查 5 结果判断,27,三、微生物限度检查（微生物计数法）,1 总则： 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。,28,三、微生物限度检查（微生物计数法）,1 总则： 环境： 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。(在不低于GMP 现行版要求的D 级洁净环
14、境、局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进行)【10版：在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内】。 检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。 单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。,29,三、微生物限度检查（微生物计数法）,1 总则： 如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。 供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。,30,三、微生物限度检查（微生物计数法）,2计数方法： 平皿法 薄膜过
15、滤法 最可能数法（Most-Probable-NumberMethod，简称MPN 法）。 MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN 法可能是更适合的方法。 供试品检查时, 应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，所选的方法必须具备检测充足样品量的能力，以保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。,31,三、微生物限度检查（微生物计数法）,3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验 供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。 供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验【10版：方法验证】，
16、以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时， 计数方法应重新进行适用性试验。,32,三、微生物限度检查（微生物计数法）,3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验 3.1菌液制备及使用 3.2计数培养基适用性检查 3.3计数方法适用性试验,33,三、微生物限度检查（微生物计数法）,3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验 3.1菌液制备及使用 菌种 试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。,34,三、微生物限度检查（微生物计数法）,3.1菌液制备及使用,35,三、微生物限度检查（微生物计数法）,3.2计数培养基适用性检查【15版】,36,三、微生物限度检查（微生物计数法）,3.2计数培养基适用性检查【15版】 每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量不大于100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试 结果判定： 被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2 范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。,
