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1、浅析DMD的临床察看与基因缺失,前言,Duehenne型进行性肌营养不良(Duehennemuseulardystrophy DMD)是脏肉系统遗传性疾病中的一种较常见的X连锁隐性遗传病,是由于肌肉中的抗肌萎缩蛋白缺如或功能障碍所致。目前尚无法治愈,只能采取对症和支持疗法,仅可缓解病情发展,改善临床症状。在分子遗传学兴起之前,DMD的诊断主要依靠典型的临床症状、体征、生化检查、肌电图、肌肉活检等可作出初步诊断。近年来,随着分子生物学的迅速发展,DNA重组技术使DMD的研究有了很大的发展,使得对DMD进行基因诊断成为现实。本文通过对38例临床医学论文DMD进行临床观察及9于外显子的缺失检测,了解
2、到我区DMD的临床有关资料及基因缺失类型和分布情况,为今后进一步的研究及携带者和产前诊断打下基础。,本文摘自 硕博论文网，如需转载，请注明出处.,材料与方法,一、病例来源。病例为广西医科大学第一附属医院儿科病房及门诊病人(均为广西区内病人),其中有五对系兄弟。二、临床检查:所有病人除了按常规进行病史的采集及体检外,重点注意有无家族史、起病时间、就诊时间、主要的临床症状(包括鸭行步态、上楼困难、走路迟、临床医学毕业论文上肢无力、智力低下)。主要的临床体征(包括肌萎缩、健反射减弱或消失、排肠肌肥大、翼状肩、Gower氏征、膜挛缩、关节畸形)生化检查及肌活检病理检查:经血清检查L的磷酸肌酸激酶(LD
3、功、肌酸激酶同工酶(CpK)氢酶(酶(Go劝、a.轻丁酸脱氢酶(a-HBDH)及其母亲的磷酸肌酸激酶(CPK);患者全部行排肠肌活检作病理检查.PCR检测基因缺失:,1.从静脉血中提取基因组DNA:将病人的静脉血Zd临床医学硕士论文收集于0.5而2%EDTA抗凝剂的10nil玻璃管中,3%明胶生理盐水,sd,混匀后静置10分钟,取上层液离心分离白细胞。Zml1SMmTES(1srnrno比Tris一HCLPHS.0,15nnnol EDTA,150 Nacl)溶解白细胞,加10%SDS至终浓度0.5%,混匀后加ZnilTES饱和酚2ml,用吸管轻轻上下抽吸使水酚两相混合,350伪,n离心10分
4、钟后,将DNA的上清夜吸出置另一试管。重复酚抽提步骤一次。加等体积的氯仿/异戊醇(24/1,V刀铲)抽提一次,方法与酚提取相似。将含DNA上清液移置一试管,缓慢加入2.5倍体积的冷乙醇,并不断摇动,使DNA析出。用TE缓冲液将DNA溶解,或加75%乙醇保存备用。,2.引物设计与合成:引物的碱基序列来自Chan由erlain,Chan由erlain等选择了DMD基因两个缺失热点区内9个易缺失的外显子的旁侧顺序为引临床医学职称论文物进行PCR扩增。图1说明了9对引物在基因内的相对位置。表1列出了每对引物的核昔酸顺序及扩增的DNA片段长度。引物由中国医学科学院生物工程研究所合成。3.PCR扩增:反应
5、体系每次反应每对缓冲液2.sul,蒸馏水16ul,NTp2.sul,DNA标本0.25ug,将上述液体混匀、离心后,加一滴石蜡油以防挥发,94预变性10分钟后加入T叫DNA聚合酶(华美生物工程公司)1.0u,最终反应体系为25ul,然后按94变性30秒,56退火1分钟,73.C.延伸1分钟,共30个周期。最后一次延伸10分钟。电泳及结果鉴定:取扩增产物sul经2%琼脂凝胶电泳,EB染色于紫外灯下观察结果。图2、3、4、5、6是正常人及其部分病人的扩增产物经电泳后在紫外灯下观测到的结果。,一、中文摘要1二、英文摘要2三、前言3四、材料与方法4五、结果8六、讨论14,讨论,Duchelme型进行性
6、肌营养不良(DMD),是最常见的X连锁隐性遗传性致死性疾病,是由于肌肉中的抗肌萎缩蛋白缺如或功能障碍所致。主要表现为肌无力引起的运动障碍、肌肉萎缩和身体畸形,进行性发展。DMD的发病率高达l/3500活产男婴,一般在5一6岁以前发病,开始常表现为自觉双下肢无力,步行摇摆(鸭行步态),平地走路易摔跤,渐发展为起立困难,不能奔跑、跳跃及顺利登楼,常于9一12岁左右丧失行走能力,大多病孩最终卧床不起,并发痉挛、挛缩、褥疮、肺炎,在20岁左右死亡。目前对DMD尚无有效的治疗方法,因此建立简便、准确的方法,检测基因携带者及产前诊断,是预防与减少发病的关键。在分子遗传学兴起之前,DMD的诊断主要依靠典型的
7、临床症状、体征、生化检查、肌电图、肌肉活检等可作出初步诊断。抗肌萎缩蛋白分子量427KD,分布于正常骨骼肌和心肌细胞的胞浆面,并且主要集Z带,在终板区域则更为密集o的生物功能萎缩蛋白一糖蛋白复合体DGC)有关。DGC是亚肌膜骨架与细胞外基质间得跨膜桥梁,是横故肌中唯一对肌浆膜起结构起支撑作用的结构。DGC可能也与信息传递、细胞内钙离子浓度的调节等细胞生物功能有关。Dys加冲hin基因突变时,DGc功能丧失,细胞内亚肌膜骨架与细胞外之间联系分割,肌膜稳定性下降或消失,最后细胞死亡t31。肌酶自细胞外溢,使血清中出现先存在于肌组织中的酶,其中血清肌酸磷酸激酶(CPK)等酶活性不但在患者的血清中明显
8、增高,有时在杂合子(60%)携带者甚至胎儿羊水中也升高,故可用,参考文献,1.MasudaT,Fujimak1N,http:/ Ozawa Eandlsl kawaH.Confoeallaser microeoPyof str0 Phinloealicationinguinea Pig Skeletalmuscul fibers.JCell Biol,1992.119:543 5482.MonacoAP, NveRL,Colletti FeenerC,etai. 3.郑瑞琴,张铭.基因移植与进行性肌营养不良。中国优生与遗传杂志,1998,6(4)4.ChamblainJS,GlbbsRA,Ra
9、iner,JE,etal.Muti Plex PCR for the diagonosis of Duehennedy stroPhy5.吴保仁,谭庆荣,宋琳琳。34例假肥大型肌营养不良的基因缺失与智能障碍的相关分析。中华儿科杂志,1997,35(8):4336.郭玉章,周延安。42例进行性肌营养不良分析与携带者筛选。临床儿科杂志。1990,8(l):45一467 二汪江,沈定国,刘红。两步一多重PCR技术诊断134例假性肌肥大型肌营养不良症基因缺失8 张成,刘悼霖,石根斌,等.抗肌萎缩蛋白的疏水结构与DMD旧MD的关系。中华医学遗传学杂志,1995,12(6):341一344 9.马生林,吴冠芸,储文明,等,两步一多重PCR技术快速检测杜氏肌营养不良基因缺失。中国医学科学院学报,1993, 10.杨军,张思仲,唐永才,等。采用多重集合酶链反应(mPCR)诊断假肥大性肌营养不良(DMD/BMD)。中华神经精神科杂志,1991,24:322,
