新药研究中的动物实验方法

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1、新药研究中的动物实验方法,2018/8/31,2,新药研究,从发现到批准投产上市，从药学、药理学、毒理学和临床医学等各方面的系统研究过程 安全性、有效性评价 药物临床前研究应当执行有关管理规定，其中安全性评价研究必须执行国家非临床研究质量管理规范（GLP）认证 从事药物临床试验的医疗机构须通过国家药物临床试验机构资格认证，必须执行药物临床试验质量管理规范（GCP）,2018/8/31,3,新药研究,主要药效学试验中的动物实验方法 急性毒性试验中的动物实验方法 长期毒性试验中的动物实验方法 安全药理学试验中的动物实验方法 生殖毒性试验中的动物实验方法 致突变试验中的动物实验方法 致癌试验中的动物

2、实验方法 刺激性、过敏性和溶血性试验中的动物实验方法 依赖性试验中的动物实验方法,2018/8/31,4,第一节 主要药效学试验中的动物实验方法,一、主要药效学研究方法 新药的主要药效学作用：应用体内外2种以上实验方法获得证明，其中一种须是整体的正常动物或模型动物 实验模型：必须能反映药理作用本质 指标：应能反映主要药效学作用的药理本质，客观可靠，能定量或半定量 主要药效学指标：心肌梗死面积 次要药效学指标：血清酶学指标 说明新药作用特点的指标：凝血、血小板功能 提示药物作用机制的指标,2018/8/31,5,第一节 主要药效学试验中的动物实验方法,一、主要药效学研究方法 剂量：应作出量效关系

3、，尽量求出ED50或有效剂量范围 给药方法：采用拟推荐临床用的给药方法，预防性给药/治疗性给药 对照： 空白对照组：正常动物对照观察，与给药组进行相同处理，检测试验方法可靠性，防止假阳性；评价造模是否成功。 模型对照组 阳性药物对照组 药物至少3个剂量组，高中低剂量差为2-3的等比级数。,2018/8/31,6,第一节 主要药效学试验中的动物实验方法,一、主要药效学研究方法 阳性对照药物选择： 已批准上市、公认最有效及作用机制相同或相似的药品。 同一受试药物在几个药效学实验模型中可采用不同的阳性对照药物 比较新药的作用特点，作用强度、起效快慢 阳性药必须出阳性结果：验证所用方法和指标的可靠性、

4、准确性、防止假阴性,2018/8/31,7,二、动物选择及模型建立,（一）动物选择 健康、符合实验动物管理要求的动物；根据实验要求选择不同等级的实验动物 动物的年龄 多采用成年动物 研究药物对生长、发育、内分泌系统作用：幼年动物 抗衰老：老年动物或衰老过程较快的专用模型动物 动物性别 雌雄各半 致畸实验或雌性生殖系统药物、热板法实验：雌性动物 男性抗生育药：雄性动物,2018/8/31,8,二、动物选择及模型建立,（一）动物选择 注意种属异同性 尽可能选用与人在生物学上接近，在解剖、生理功能相类似的动物，应选用靶器官高效应实验动物每组大鼠、豚鼠、家兔等动物一般不得少于8只；犬和猴等大动物可设2

5、个剂量组，每组不得少于6只；以避免个体差异和实验误差，以便进行统计学处理,2018/8/31,9,药效学试验中的动物选择,2018/8/31,10,二、动物选择及模型建立,（二）模型建立 动物模型的治疗效果与人体使用结果基本相同：抗感染动物模型、小鼠镇痛模型、豚鼠过敏性哮喘模型 无合适的模型：银屑病、秃发、红斑狼疮、视网膜炎等，可采用间接指标，如改善皮肤微循环、测量毛发生长速度、数量与弹性，测定皮肤胶原蛋白含量及观察眼结膜的微循环等 不大好建立的模型：癫痫、慢性萎缩性胃炎等。需要多种方法验证 某些疾病模型至今无法建立：神经官能症、精神病、眩晕症、四肢麻木、幻觉等,2018/8/31,11,二、

6、动物选择及模型建立,（二）模型建立 药效学实验，至少有一种整体模型； 采用多种方法制备动物模型，以评价药物疗效 老年痴呆动物模型：胆碱能损伤模型；b淀粉样蛋白致痴呆模型 注意模型损伤程度，严重损伤模型难以显示药物疗效 特异性好、能反映药理作用本质的离体实验模型亦可 蛙坐骨神经腓肠肌标本：肌松药研究 果蝇：抗衰老药物 注意整体动物模型与体外模型的药理反应之间的差别,2018/8/31,12,第二节 药物临床前安全性评价的意义和局限性,一、临床前安全性评价的意义： 提供新药对人类健康危害程度的科学依据，预测上市新药对人体健康的有害程度通过药物毒理学的研究方法和手段来进行 观察和测定化学物质对机体引

7、起的损害，发病机制以及对机体全身的影响,2018/8/31,13,二、动物毒性试验评价的局限性,实验动物和人对药物反应种属性差异：动物和人共同反应约占一个药总反应的25%。 实验动物的数量有限：发生率低的毒性反应，在少量的动物中的难以发现 实验动物的反应单一；临床病人广泛，对药物的敏感性各不相同 实验动物与人的生理状态差异：某些疾病的存在是发生某些毒性反应的重要前提 试验剂量与临床剂量的差异,2018/8/31,14,三、安全性评价的基本要求,找出毒性剂量：LD50；长期给药产生毒性的剂量 确保安全剂量范围：单次或多次给药的有效范围 发现毒性反应 毒性靶器官的寻找 毒性的可逆与否：不可逆损伤，

8、一般不批准上临床 解救措施,2018/8/31,15,第三节 急性毒性试验中的动物实验方法,急性毒性试验（单次给药毒性试验） 研究动物一次或24h内多次给予受试物后，一定时间内所产生的毒性反应 药物毒理研究的早期阶段,2018/8/31,16,急性毒性试验 作用,阐明药物的毒性作用及其毒性靶器官 为长期毒性试验剂量和药物期临床实验起始剂量的提供剂量依据 提供一些人类药物过量急性中毒相关的信息,2018/8/31,17,一、主要内容和要求,受试物：制备工艺稳定、符合临床试验用质量标准规定的样品；标明名称、来源、批号、含量、保存条件、配制方法等，自检报告。所用辅料、溶媒 动物：至少采用2种哺乳动物

9、， 啮齿类：大鼠、小鼠 非啮齿类：犬（Beagle犬、杂种犬）、猴 根据实验特点，确定动物性别、年龄 初始体重差异在平均体重20%以内，小鼠（18-22g），犬（9-11kg），猴（3-6kg） 实验动物质量合格证,2018/8/31,18,一、主要内容和要求,剂量和分组： 应从未见毒性剂量到出现严重毒性（危及生命）的剂量 设空白和/或溶媒对照组 小动物4-6个剂量组，组距0.65-0.85；大动物一般6只犬，采用50%等量递升法，求出ALD（近似致死剂量）和MTD（最大耐受量） 给药容积：等容积不等浓度给药， 给药途径： 临床拟用途径和一般能使原形药物较完全进入循环的途径； 经口给药前动物一

10、般应进行一段时间的禁食不禁水,2018/8/31,19,一、主要内容和要求,观察时间及指标： 给药后，一般连续观察至少14天，给药当天，尤其是4h内严密观察。后每天上下午各一次 毒性反应出现时间及其恢复时间 一般指标：动物外观、行为、对刺激的反应、分泌物、排泄物等 死亡情况（死亡时间、濒死前反应） 体重变化 病理学检查： 大体解剖：体积、颜色、质地 组织病理学检查,2018/8/31,20,二、急性毒性实验常用方法,（一）近似致死剂量法 非啮齿类动物的急性毒性试验 6只健康比格犬（4-6月龄）或猴（2-3岁） 估计可能引起毒性和死亡的剂量范围按50%递增法，一般设计出含10个左右剂量的剂量序列

11、表； 根据估计，由剂量序列表中找出可能的致死剂量范围,2018/8/31,21,（一）近似致死剂量法,2018/8/31,22,（二）最大给药量法,适用于低毒的受试物 在药剂上允许的最大给药浓度及生理上允许的最大给药剂量的条件下，以允许的最大剂量单次给药或24h内多次给药（剂量24h。观察期7天,2018/8/31,24,（三）固定剂量法,正式试验： 每个剂量至少10只动物，雌雄各半 根据预试结果，在4个剂量中选择一个可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量，如预试结果表明，5mg/kg引起死亡，则降低一个剂量档次进行 观察时间 2周，根据毒性反应具体特点可适当延长,2018/8/31,25,（三

12、）固定剂量法试验结果评价,2018/8/31,26,（四）上下法（阶梯法、序贯法）,特点：节省动物；同时进行毒性症状的观察、估算LD50及其可信限，适合能引起动物快速死亡的药物限度试验：用于有资料提示受试物毒性可能较小的情况 主试验：用于相关毒性资料很少或没有时，或预期受试物有毒性时,2018/8/31,27,（四）上下法（阶梯法、序贯法）,限度试验：最多用5只动物进行的一个序列试验 2000mg/kg剂量水平的限度试验,存活,2018/8/31,28,（四）上下法（阶梯法、序贯法）,限度试验： 5000mg/kg剂量水平的限度试验3只死亡，LD503只存活，LD505000mg/kg,死亡,

13、2018/8/31,29,（四）上下法（阶梯法、序贯法）,主试验： 特定给药程序 每次给药1只动物，间隔约48h（取决于毒性出现时间，持续时间和毒性的严重程度） 第一只动物剂量低于LD50的最接近的估计值 该动物存活，第2只给予高一级剂量 该动物死亡或出现濒死状态，给予低一级剂量 剂量级数因子：（1/剂量反应曲线斜率估计值） 的反对数 无受试物斜率相关资料时，使用3.2为剂量级数因子；1.75mg/kg、5.5、17.5、55、175、550、2000（或5000） 无受试物致死估计值时，从175开始,2018/8/31,30,（四）上下法（阶梯法、序贯法）,主试验 决定是否和如何对下一只动物

14、给药前，每只动物均应认真观察达48h 当满足停止试验标准之一后，停止给药，根据终止时所有动物的状态计算LD50估计值和可信区 停止试验条件： 连续3只动物存活 任意连续6只动物中有5只连续发生存活或死亡转换 第1只动物发生转换之后至少有4只动物进行实验，并且通过计算LD50估算值的范围超出临界值（2.5倍）,2018/8/31,31,（五）累积剂量设计法（金字塔法）,非啮齿类动物急性毒性实验 8只动物，对照组+给药组，雌雄各半 剂量设计（mg/kg） 1、3、10、30、100、300、1000、3000 10、20、40、80、160、320、640、1280 隔日给予下一个高剂量，剂量逐渐

15、增加，直至出现动物死亡或达到剂量上限位置,2018/8/31,32,（五）累积剂量设计法（金字塔法）,无动物死亡时，MLD（最小致死剂量）和LD50大于最高剂量或限制剂量 以最高剂量给予动物5-7d 某一剂量所有动物死亡，MLD和LD50应在最后两个剂量之间 某一剂量部分动物死亡，并有部分死亡出现在后继的下一个高剂量，MLD位于首次出现死亡的剂量和前一个低剂量之间，LD50应在首次出现动物死亡的剂量和所有动物均死亡的剂量之间,2018/8/31,33,（六）半数致死量法,预备实验：先找出100%及0%死亡的剂量，即Dm，Dn 取小鼠9-12只，每组3只，按估计量给药 3只小鼠全死，降低剂量 全

16、不死，增加剂量 确定组数n，计算各组剂量（按等比级数排列）,dn=d(n-1)r,2018/8/31,34,（六）半数致死量法,正式实验： 分组：每组10只，雌雄各半，随机分配 给药：每只动物给药容量相同 观察记录：给药后中毒表现，记录各组小鼠死亡数，死亡率。 计算LD50及LD50 95%可信限,2018/8/31,35,第四节 长期毒性试验中的动物实验方法,长期毒性试验（重复给药毒性试验） 反复多次给予动物药物，观察药物对动物的毒性反应，一般指连续给药14d以上。 目的、意义 预测受试物可能引起的临床不良反应，包括不良反应的性质、程度、剂量-反应关系和时间-反应关系、可逆性等 判断受试物反复给药的毒性靶器官或靶组织 推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全剂量范围 提示临床试验中需重点监测的指标 为临床试验中的解毒或解救措施提供参考,