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1、实验六酵母 RNA 的分离及组分鉴定【实验目的】了解核酸的组分,并掌握鉴定核酸组分的方法。【实验原理】酵母核酸种RNA 含量较多。 RNA 可溶于碱性溶液, 在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。由此即得到RNA 的粗制品。核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解,从水解液中可以测出上述组分的存在。鉴定依据: 磷酸与定磷试剂反应产生蓝色物质。核糖与苔黑酚作用产生绿色物质。嘌呤碱与硝酸银能产生白色的嘌呤碱银化合物沉淀。【实验器材】150 ml 锥形瓶、水浴、量筒、漏斗及抽虑瓶、吸管7、滴管 8、试管及试管架9、烧杯 、离心机、漏斗【试剂和材料】1、 0.
2、04 mol/L 氢氧化钠溶液;2、酸性乙醇溶液:将0.3 毫升浓盐酸加入30 毫升乙醇中;3、95%乙醇;4、乙醚;5、1.5 mol/L 硫酸溶液;6、浓氨水;7、0.1 mol/L 硝酸银溶液;8、三氯化铁浓盐酸溶液:将 2 ml 10% 三氯化铁溶液 (用 FeCl3 6H2O 配制) 加入到 400 ml 浓盐酸中;9、苔黑酚(地衣酚)乙醇溶液:溶解6 g 苔黑酚于100 ml 95% 乙醇中(可在冰箱中保存一个月);10、定磷试剂:(1)17% 硫酸溶液:将19 ml 浓硫酸(比重1.84)缓缓加入到83 ml水中( 2)2.5% 钼酸铵溶液:将2.5 g 钼酸铵溶于100 ml
3、水中( 3)10% 抗坏血酸溶液:10 g 抗坏血酸溶于100 ml 水中,贮棕色瓶保存(溶液呈淡黄色时可用,如呈深黄或棕色则失败,需纯化抗坏血酸) 。临用时将上述3 种溶液与水按如下比例混合。17% 硫酸溶液: 2.5% 钼酸铵溶液: 10% 抗坏血酸溶液:水=1:1:1:2 (V/V) ;11、酵母粉。【实验操作】1、溶解 RNA 将 5 g 酵母悬浮于90 ml 0.04 mol/L 氢氧化钠溶液于150 ml 锥形瓶中, 在沸水浴中加热30 分钟,制成碱提取液,将其冷却。2、解聚 RNA 将冷却的碱提取液离心(6000/min) 5 分钟,将上清液用乙酸调节pH 至酸性(pH56 )
4、)缓缓倾入30 ml 乙醇溶液中,注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后,离心(6000/min)5 分钟。弃去清液。3、洗涤沉淀,抽滤得RNA 采用倾倒法用95% 乙醇洗涤沉淀两一次,即得 RNA 。4、RNA 各组分鉴定(1)水解液制备取 200 mg 提取的核酸, 加入 1.5 mol/L 硫酸溶液10 ml,在沸水浴中加热10 分钟后即得核酸水解液。(2)组分鉴定 嘌呤碱的鉴定取水解液 1 ml 加入过量浓氨水,然后加入约1 ml 0.1 mol/L 硝酸银溶液, 观察有无嘌呤碱的白色银化合物沉淀。 核糖的鉴定取 1 支试管加入水解液1 ml ,三氯化铁浓盐酸溶液2 ml 和苔黑酚乙醇溶液0.2 ml。放沸水浴中10 分钟。溶液变成绿色,说明核糖的存在。 磷酸的鉴定取 1 支试管加入水解液1 ml 和定磷试剂1 ml ,在水浴中加热,溶液变成蓝色,说明有磷酸的存在。