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1、2016生物一轮复习34讲,动物细胞工程,单克隆抗体,动物细胞培养,核移植,动物细胞融合,是动物细胞工程技术的基础,胚胎移植,1.动物细胞培养的条件,无菌、无毒的环境添加一定量的抗生素，定期更换培养液 营养 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等 温度和PH温度36.5+0.5度，pH7.27.4 气体环境O2和CO2（95%空气和5% CO2 ）,（一）动物细胞培养,动物细胞生长特性：,细胞贴壁生长：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上生长，称为细胞贴壁。,细胞在贴壁生长过程中,随着细胞分裂,数量不断增加,最后形成一个单层,此时细胞间相互接触,细胞分裂和生长停止。,接触抑制,原代培
2、养：培养第1代细胞到10代细胞 传代培养：从10代培养到4050代细胞 细胞株：从10代到4050代的细胞，遗传物质不变 细胞系：50代以后的细胞，遗传物质改变，具有癌变的特点，能无限增殖,几个有关概念：,注：细胞系的细胞有癌变特点，但不是癌细胞。,胰蛋白酶处理？,取出组织,胚胎或幼龄动物器官组织,剪碎,单个细胞,细胞浮悬液,原代培养,10代细胞,50代细胞,无限传代,传代培养,细胞株,细胞系,遗传物质改变,2.过程：,胰蛋白酶处理？,遗传物质未改变,细胞贴壁,思考与讨论,1、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？2、用胰蛋白酶分散细胞，由此可说明细胞间的物质
3、主要是什么成分？3、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？,因为这些组织或器官，分裂能力旺盛，易于培养。,主要是蛋白质(胶原蛋白等)。,不能，因为动物细胞培养适宜的PH为7.27.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体,5.植物组织培养和动物细胞培养的比较,细胞的全能性,细胞的增殖,固体培养基,液体培养基,蔗糖、植物激素,葡萄糖、动物血清,新植株,细胞株、细胞系,快速繁殖、培育无病毒植株等,获得细胞或细胞分泌蛋白,注：植物的培养基中
4、也可用葡萄糖，但成本较高,细胞A,细胞B,杂种细胞,生物法：灭活的仙台病毒,物理法、化学法,（二）动物细胞融合,2、过程：,1、概念：2种动物细胞杂种细胞,制备单克隆抗体,3.植物体细胞杂交和动物细胞融合比较,细胞膜的流动性、 植物细胞的全能性,细胞膜的流动性,用纤维素酶、 果胶酶去壁,用胰蛋白酶 使细胞分散,物理、化学方法,物理、化学、 生物方法,获得杂种植株,主要用于制备 单克隆抗体,1.单克隆抗体概念：,2.单克隆抗体特点：化学性质单一、特异性强、灵敏度高,（三）单克隆抗体,技术原理：,1）单个B淋巴细胞产生单一抗体： 但不能无限增殖,2）肿瘤细胞能无限增殖： 但不能分泌单一抗体,3）细
5、胞融合技术杂交瘤细胞： 既无限增殖又分泌单一抗体,4）动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞： 获取大量单克隆抗体,免疫小鼠,培养骨髓瘤细胞,融合,骨髓瘤细胞,B淋巴细胞,注射特定抗原蛋白,选择培养基上培养,专一抗体检验阳性,专一抗体检验阳性,注射到小鼠体内,体外培养,单克隆抗体,克隆杂交细胞,分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，检验阳性细胞,多种杂交细胞,杂交瘤细胞有何特点？,本过程利用的那些技术？,动物细胞融合技术 动物细胞培养技术,是否注射抗原,（只考虑两两融合）培养液中细胞有几种类型？几种融合细胞？,两次筛选的目的分别是什么？,2、单克隆抗体制备过程,与传统制备的抗体相比具有什么特点？,B淋巴
6、细胞,注射特定抗原蛋白,骨髓瘤细胞,培养骨髓瘤细胞,融合,（只考虑两两融合）培养液中细胞有几种类型？融合细胞几种类型？,骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞 B淋巴细胞- B淋巴细胞 B淋巴细胞-骨髓瘤细胞,多种杂交细胞,在具有筛选作用的培养基上培养,专一抗体检验阳性,克隆上述杂交细胞,分开不同杂交细胞，克隆专一抗体， 检验阳性细胞,单克隆抗体,注射到小鼠体内,体外培养,2、单克隆抗体的制备过程,第1次筛选目的：得到杂交瘤细胞（多种）。,第2次筛选目的：在杂交瘤细胞中筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。,该细胞继承双亲细胞的遗传特性，既能产生专一抗体又能无限增殖。,杂交瘤细胞有何特点？,特异性强，灵敏度高并可
7、能大量制备,整个制备过程为何要经过两次筛选?为什么给小鼠注射特定的抗原蛋白？会有几种融合方式？是否所有的杂交瘤细胞都能产生专一性抗体？,第一次筛选：用特定的选择培养基筛选出多种杂交瘤细胞 第二次筛选：筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。,思考：,为了获得产生相应抗体的B细胞,BB 、B瘤 、瘤瘤 （B、瘤）,通过恰当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的。 （1）取出阳性孔的细胞数进行计数 （2）用培养液将其稀释到10Cellml （3）如果在多孔板，每孔加0.1ml，其几率为每孔内落入一个细胞 （4）根据检测的阳性结果可进行克隆化, , , ,m,m, , , , , , ,4.单克隆抗体的应用
8、：,（1）制成单抗诊断盒,（2）,运载药物：制成“生物导弹”,治疗疾病：主要用于癌症治疗,用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体制备成“早早孕诊断试剂”。 受精后不久，胎盘滋养层细胞会分泌人绒毛膜促性腺激素（HCG)，是由受孕妇女体内胎盘产生的一种糖蛋白类激素，在妇女的尿液中大量存在，而非妊娠妇女尿液中几乎没有。,早孕试纸利用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体为配体，固定在层析住上，以胶体金为指示标记，检测尿液中HCG浓度，来确定妇女是否怀孕。 阳性：出现两条红色条带，一条位于对照区C，另一条位于检测区T，表明已怀孕。 阴性：仅在对照区C出现一条红性条带，在检测区T无红色条带出现，表明未怀孕。 无效：5
9、分钟内在对照区C无红色条带出现，则测试失效或试纸已失效。,甲胎蛋白（AFP）是一种特异性较强的肿瘤标志物，用甲胎蛋白作为抗原免疫小鼠，制备抗AFP单抗，并与含有放射性同位素的标记物连接，单克隆抗体携带放射性标记物通过全身血液循环运送到所有组织，由于肿瘤细胞表面的AFP会和单克隆抗体特异性结合，所以放射性同位素标记物就不断积累在肿瘤上，通过一定的显影技术就可发现肿瘤所在。,生物导弹：用癌细胞作为抗原，免疫小鼠制备抗癌细胞的单克隆抗体，并与抗癌药物连接，便制成了生物导弹，注入患者体内，借助单克隆抗体的导向作用，将药物定向带到癌细胞所在位置，在原位杀死癌细胞，这样既不损伤正常细胞，又减少了药剂用量。
10、,生物导弹单克隆抗体抗癌药物,细胞膜的流动性、细胞的全能性,细胞膜的流动性、细胞增殖,酶解法去壁,小鼠免疫处理、细胞分散,物理法 化学法,物理、化学、生物法,原生质体的制备,融合亲本细胞的准备,原生质体的融合与筛选,动物细胞融合与两次筛选,杂种细胞的形成与培养,产特定抗体的杂交瘤细胞培养,杂种植株的鉴定,单克隆抗体的分离提纯,单抗有助于疾病的诊断、治疗、预防,获得具优良性状的杂种植株,二.动物体细胞核移植和克隆动物,（一）核移植：将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，使这个新的胚胎最终发育成为动物个体。 （二）克隆动物：用核移植技术得到的
11、动物。 克隆：通过无性生殖而产生的具有完全相同的遗传组成的一群细胞或生物的个体，克隆在希腊语中是“小树枝叶”的意思，用以指无性增殖动物，现在指个体，细胞，基因等不同水平上无性增殖动物。,（2）为什么受体细胞是卵细胞？,细胞比较大，易操作；细胞质中含有使体细胞核全能性表达出来的所需物质。,问题深化：,（1）克隆动物性状与供体动物完全一样吗？,不是。因为：供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质来自于受体卵细胞；生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。,（3）利用的原理：,动物细胞核具有全能性,无性繁殖,（4）这种繁殖后代的方式属于哪一类？,细胞质,细胞核,细胞核移植,核移植技术：将动物的
12、一个细胞的细胞核，移入一个已经去核的卵母细胞中，使其重新并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成为动物个体。分为：胚胎细胞的核移植和体细胞核移植。,试管动物（婴儿）培养过程,卵细胞,精子,受精卵,新个体,胚胎移植,（五）胚胎移植技术,有性繁殖,思考：这种繁殖后代的方式又属于哪一类？,供体细胞培养,（M卵母细胞）,减数第二次分裂中期,去核的卵母细胞,供体细胞注入去核卵母细胞,激活受体细胞，完成分裂、发育,胚胎移植,代孕牛子宫,克隆牛,3、过程：,1、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？,2、用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，为什么？,
13、为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。,10代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未发生突变,3、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？,不是，克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但核外还有少部分DNA（如线粒体DNA）来自受体卵母细胞,（三）体细胞核移植技术的应用,1、畜牧业方面：,2、医药卫生方面：,可以加速家畜遗传改良的进程，促进优良畜群繁育。,保护濒危物种，增加其存活数量,生产医用蛋白质,组织器官的移植,3、其他领域,了解胚胎发育及衰老过程,更好追踪研究疾病的发展过程、治疗疾病,（四）体细胞核移植技术存在的问题,1、成功
14、率低,2、克隆动物存在健康问题,1进行动物细胞培养时，通常选用的培养材料是（ ）A衰老退化的动物组织细胞B成熟动物个体的体细胞C动物的受精卵细胞D动物胚胎或幼龄动物个体的细胞 2为使培养的动物组织细胞分散开，以便配制成一定浓度的细胞悬浮液，选取的动物组织进行处理时应首先选用下列物质中的（ ）A胃蛋白酶 B胰蛋白酶C盐酸 D胰脂肪酶,D,B,3获得大量单克隆抗体必须用单个的B细胞进行无性繁殖，形成细胞群。其原因是（ ）A在体外培养条件下B淋巴细胞可以无限增殖B每一个B淋巴细胞都参与特异性免疫反应C在动物体内B淋巴细胞可产生多达百万种以上的抗体D每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 4在动物细胞培
15、养中，有部分细胞可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为（ ）A原代细胞 B传代细胞C细胞株 D细胞系,D,D,5关于制备单克隆抗体的叙述正确的是 A、单克隆抗体产自淋巴细胞 B、单克隆抗体的制备要经过细胞融合C、单克隆抗体的获得不需要使细胞癌变 D、诱导融合的手段相同6试管婴儿试管苗克隆羊 这三者可以说是现代生物工程技术的杰出成就，它们的诞生所依据的生物学原理最接近的是 A、 B、 C、 D、,B,B,提示：和依据的原理都是细胞的全能性，而依据的原理是体外受精。,（1）该方案能达到预期效果吗? 。原因是？（2）图中为 过程，常用 诱导剂。该细胞继承了_。 （3）图中进行细胞培养，目的是 。 （4）图中的细胞培养，能获得细胞，便于大规模培养。 （5）破伤风杆菌的抗体最终可从和 中提取。 （6）该方案的目的？,制备单克隆抗体,不能；没有将抗原注射到小鼠体内，无法得到产生此种抗体的效应B细胞,双方细胞的遗传物质，能产生特异性抗体，体外培养条件下能大量繁殖,
