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1、脐血干细胞及其应用,干细胞相关知识扩展,第一部分,“干细胞”的概念在数十年前就已有介绍，但是直到目前，仍然还无法从形态或表型界定干细胞，而只能根据其功能定义。 干细胞具有两种特定的功能。增殖功能指干细胞具有自我更新能力，可以生成更多的干细胞；分化功能则指干细胞能分化成为各种祖细胞，后者可以进一步分化成各种特定成熟细胞系。 因此，目前干细胞的最好界定方法是功能学法 。,胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)被认为是最多能的干细胞群体 ，具有最大的发展潜能，对胚胎细胞或组织的利用还存在伦理学争议 。 成人干细胞。在许多成人组织中已经发现有多种干细胞群体存在，如骨髓中的造血干细
2、胞，以及其他骨髓衍生干细胞(BMSC) 能分化为血细胞和多种组织细胞。为了避免潜在的伦理学问题，克服免疫不相容性，在未来的组织工程中自身成人干细胞可能成为理想的选择。 脐带血干细胞的特性和用途可能有效地替代骨髓和外周血。 对脐带血干细胞的特性和用途正在进一步的探索。,干细胞的分离,体外实验技术以识别干细胞表面标记物作为基础，如CD34、AC133、STRO-1和神经营养素受体p75等已经用于干细胞的纯化实验，包括细胞淘选、荧光激活细胞分类、免疫磁性选择和免疫吸附柱分离等。目前有证据表明，如果利用某种单一的标记物分子进行干细胞分离，而对不表达该标记物的新干细胞群体尚未充分研究，则不能完全肯定分离
3、结果。例如，干细胞活性与CD34分子在细胞膜上的表达不完全相关，小鼠体内存在一大群“静默”干细胞，它们不表达CD34分子但仍具有完整的重建能力。在人体内也发现存在类似的CD34阴性休眠生血干细胞。因此，在未来实验中应设计新的方案，以成熟细胞系的标记物作为细胞转移基础会更有效。,干细胞的扩增,为了克服干细胞数量少的不足，众多学者已经在探索干细胞的体外扩增方法。 但是，如何在长期的扩增过程中使干细胞不分化而又保持其多系分化能力成为一大难题。在干细胞临床实际应用中，理论上认为需要一个无基质、无血清的体外系统，并用已知的细胞因子和生长因子维持。 白细胞介素-3(IL-3)、干细胞因子(SCF)和Flt
4、-3配体(FL)具有非细胞系特异性的早期生血刺激作用，可用于脐血干细胞的增殖培养。 血小板衍生生长因子(PDGF)-BB和表皮生长因子(EGF)是最有效的人类骨髓衍生干细胞克隆生长支持因子 。 从人类发育中的脑皮层中已成功分离出神经前细胞，并利用表皮生长因子和纤维母细胞生长因子-2(FGF-2)使其扩增。 进一步的研究，如系统性分析生长因子受体的表达，将有助于设计新的干细胞体外扩增培养方案。,干细胞的分化,在干细胞研究中，热点之一是调控细胞向预定群体分化 。 过去数年间，关于干细胞在体内以及体外分化成各种成熟细胞的报道大批涌现。干细胞最重要的细胞外调控信号之一是生长和分化因子。转化生长因子-(
5、TGF-)家族成员对胚胎干细胞和神经脊干细胞有显著的促分化效应，Wnt家族分子在多种不同的细胞分化中也起着重要作用。但是，由于还无法得到纯化的功能性Wnt蛋白，对于多种Wnt因子的确切效应的更深入研究受到了限制。除了各种分泌因子外，整合膜蛋白和整合素、细胞外基质在干细胞调控微环境中也发挥作用。,细胞因子的特点和作用,细胞产生的具有生物学活性的小分子蛋白质。产生和作用的高效性、多样性、瞬时性。 细胞因子的作用通过与细胞表面相应受体结合而起作用。 一般培养细胞中细胞因子的使用量为5ng100ng/ml,有量效关系。 细胞因子间有协同作用、相加作用、拮抗作用 用于细胞增殖的细胞因子 造血干细胞：Fl
6、t-3 ligand, SCF, TPO, IL-3, IL-7, IL-11 树突状细胞：GM-CSF, G-CSF, IL-1beta, IL-4, TNF alpha 神经干细胞：EGF, FGF-basic 间充质干细胞：EGF, PDGF-AA 胚胎干细胞：FGF-basic 用于细胞分化诱导的细胞因子 Activins, BMPs, Cripto-1, Dkk-1, FGF-8, GDFs, Lif, Nodal, Noggin, Notch, Shh, TGF beta, Wnts,第二部分,脐血干细胞特点与应用,脐带血干细胞,造血干细胞 CD133、CD34等+,间充质干细胞
7、CD13、29、44、105等+,SCF、CSF 、IL-3,6 等可刺激细胞扩增,采用密度梯度离心法和贴壁法分离,采用密度梯度离心法和免疫磁珠法分离,调整培养基偏酸性，1%pen-strep,不同诱导分化条件分化为不同细胞,脐血造血干细胞的含量等于或超过骨髓。造血谱系标记,如CD3、CD14、CD19、CD34、CD45 等呈阳性。在体外对脐血祖细胞进行培养,发现使用SCF 加G-CSF、 GM-CSF、IL-3、IL-6等作为刺激因子培养 ,细胞集落形成 增加,脐血中的造血干细胞有更大的潜在分化和增殖能力。 从脐血中分离出单核细胞,在体外培养,贴壁细胞形态表现为破骨细胞样细胞和间充质样细胞
8、两种,间充质样细胞表达多种间叶祖细胞(MPCs) 的相关抗原( SH-2 、SH-3 、SH-4 、ASMA、MABl470、CDl3 、CD29、CD44、CD105) 。用含2 %和5 %较低血清浓度的条件下,脐血单个核细胞可分化成较为均一的间充质样细胞,并可以在数量上扩增的同时,保持其多向分化的潜能，在一定条件下可以诱导分化为神经细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肝细胞等。,采用MiniMACS分选系统分离脐血CD34 +细胞,其纯度可达到(83. 13 10. 73) %,得率一般为1%。 采用新鲜的脐血分离CD34 + 单个核细胞。一般(25) 108脐血单个核细胞
9、能分离出(35) 106 CD34 +细胞。,脐血、成人外周血和骨髓CD34+含量（xS） 标 本 标本数（n） CD34+含量（%） 成人骨髓 7 3.191.05* 脐血 48 2.141.23* 成人外周血 48 0.190.14 *骨髓与脐血比较P0.05；*脐血与外周血比较P0.001 骨髓与外周血比较P0.05）,脐血和成人外周血淋巴细胞表型及NK细胞活性（x S）脐血 成人血 CD3 50.012.4 73.38.9 CD4 40.112.4 40.77.1 CD8 13.84.3 27.05.5 CD4/CD8 3.21.5 1.60.4 CD16 16.96.2 11.96.
10、3 NK-A 17.812.4 40.821.6 脐血与成人血比较，P0.01。,脐血清与成人外周血清中IL-2、TNF、SIL-2R水平（xS）标本 样品数量 IL-2 （pg/ml） TNF （pg/ml） SIL-2R （pg/ml） 脐 血 40 42 40 181.4113.3 5.510.92 214.096.1 成人血 37 35 37 305.2125.4 7.451.58 112.172.5P值 0.01 0.01 0.01,不同血清培养体系中脐血CFU-GM产率（xS，n=5） 刺激因子 脐血清 脐血清+GM-CSF 胎牛血清 胎牛血清+GM-CSF 集落产率/ 10.63
11、.8 37.411.6* 0 12.84.0 1105 细胞 *脐血清与胎牛血清比较P0.01 脐血清对脐血细胞有体外促增殖作用，而胎牛血清则无此作用，说明脐血清含有促CFU-GM生长的造血活性物质。 在培养体系中加入GM-CSF时，集落数都增加，但脐血清组增加显著，说明脐血清中含有与外源性GM-CSF协同因子。,脐血清与成人外周血清中集落刺激活性（CSA）、白细胞介素3（IL-3）、粒巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）水平,脐血、成人血清中CSA、IL-3、GM-CSF活性比较（xS）血 清 脐血清（U/ml） 外周血清（U/ml） CSA 248.30155.97 4.381.89GM-
12、CSF 197.78111.01 112.0991.91* IL-3 638.3205.9 66.839.3 脐血中含有高水平的CSA，之中以IL-3含量为主，而GM-CSF含量很低。 t值 12.9， P值 0.001,研究方法：1粒系集落计数法 2脐血粒巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）微量培养法 3MTT法,脐血治疗疾病的显著优点,(1) 来源丰富,易于获得; (2) 取血时对于母体和婴儿均无痛苦; (3) 脐血可以长期储存 ; (4) 发生移植物抗宿主病的发生率低 ; HLA-DR、CD80、CD86 阴性表达;其中,HLA-DR位点是异基因移植时免疫排异反应发生的主要位点;CD80
13、 和CD86 是移植物抗宿主病(GVHD) 发生的最重要共刺激通路B7/ CD28 的信号分子。 (5) 脐血中含各种原始细胞如造血干细胞、间充质干细胞,具有较强的增殖分化的能力; (6) 脐血中各种病毒感染的几率相对较少。 近年来,脐血由于其独特的生物学特点,储存数量及进行脐血治疗的患者日益增多。,SCF/CSF/IL-3等刺激细胞扩增 bFGF/EGF/NGF/IGF等促进细胞定向分化,CD34+细胞向神经元样细胞的分化,多种细胞因子的组合会更好。但细胞因子和细胞因子之间存在协同作用、拮抗作用、叠加作用等,IL-3能促进G0期造血干细胞（静默干细胞）进入细胞增殖周期，IL-6可协同IL-3支持多能干细胞分化增殖。,MSCs向神经元样细胞的分化,脐血单个核细胞106/cm2 接种于MesencultTM培养液(Stem Cell 公司) 中,调整培养基偏酸性，1%pen-strep ，37 、5 %CO2培养。1 周后,更换培养基,弃掉未贴壁细胞。以后每3 d 换液1 次。细胞长到80 %融合时,用11 的2. 5 g/L 的胰蛋白酶和0. 2 g/L EDTA 混合液消化(在显微镜下控制消化时间) ,以8. 0 103/cm2 的密度接种于传代培养瓶中进行扩增培养。,
