PCR和RT-PCR区别

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1、PCR 和 RT-PCR PCR 和 RT-PCR 基础PCR 基础聚合酶链式反应（ PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增 DNA 序列。这是一个指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般，经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。反应包括几个成分（表 1）。模板可以为纯化的基因组或质粒DNA ；由 RNA 转化得到的 cDNA ；或未经纯化的粗制生物样品， 如细菌克隆或噬菌斑。 引物确定了扩增产物的序列和长度。最常用的热稳定聚合酶是Taq DNA 聚合酶。这种酶适用于常规扩增，但是

2、使用其他热稳定聚合酶会改善结果。扩增反应还包括缓冲液， 三磷酸脱氧核苷及镁离子。镁离子浓度影响酶的活性、引物退火、模板和PCR 产物的熔点（Tm），忠实性以及引物二聚体的形成等。在随后的章节中将讨论这些成分、循环参数以及其他参与作用的因子相互间各种作用对于成功PCR 的影响。表 1. 反应成分ComponentFinal ConcentrationTemplate 104-106 copies of DNA template Primer 1 0.1-0.5M Primer 2 0.1-0.5M 10X Reaction buffer 1X Magnesium 1.0-3.0mM dNTP m

3、ix 200 mM each dNTP Thermostable DNA polymerase 1-4 units/100 ml reaction RT-PCR 基础RT-PCR 将以 RNA 为模板的 cDNA 合成同 PCR 结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR 用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA 文库克隆cDNA 。RT-PCR 比其他包括 Northern 印迹、 RNase 保护分析、原位杂交及S1 核酸酶分析在内的RNA 分析技术，更灵敏，更易于操作。RT-PCR 的模板可以为总RNA 或 poly(

4、A)+ 选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT) 或基因特异性的引物 （GSP ）起始。RT-PCR 可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR 中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA 的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10 的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR 中，逆转录和 PCR 在同时为逆转录和PCR 优化的条件下，在一只管中顺次进行。图 1. RT-PCR 概图这本指南阐述了成功RT-PCR 和 PCR 的关键。 高灵敏性（从小量样品中得到足量结果）和高特异性（选择性地仅得到所需的产物）是成功PCR 的标志。可以通过仔细的实验设计

5、 （如选择恰当的酶， 设计最理想的引物， 使用不同的缓冲液和添加剂，确定循环参数及制备高质量的模板等）以获得最佳的RT-PCR 和PCR。增加 RT-PCR 灵敏度分离高质量 RNA 成功的 cDNA 合成来自高质量的RNA。 高质量的 RNA 至少应保证全长并且不含 逆转录酶的抑制剂，如EDTA 或 SDS 。RNA 的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA 纯化方法是使用异硫氰酸胍酸性酚的 一步法。 Trizol 试剂法（见下图）将一步法加以提高，可以从多种组织和细胞中 提取高质量的非降解RNA。Trizol 试剂法可以从最少100 个细胞或 1mg 组织中 提

6、取 RNA。 TRIzol? 试剂步骤略图一般不必使用 oligo(dT) 选择性分离 poly(A)+RNA 。 不管起始模板是总RNA 还是 poly(A)+ RNA ，都可以检测到扩增结果（图2）。另外，分离poly(A)+ RNA 会 导致样品间 mRNA 丰度的波动变化， 从而使信息的检出和定量产生偏差。然而， 当分析稀有 mRNA 时，poly(A)+ RNA 会增加检测的灵敏度。图 2. 总 RNA 和 poly(A)+ RNA 在 RT-PCR 中的比较 以 5 或 1g Hela细胞总 RNA（分别为泳道 1 和 2）或 500ng 和 50ng Hela 细 胞 poly(

7、A)+ RNA （分别为泳道 3 和 4）。使用 oligo(dT) 引物和 SuperScript 逆 转录酶合成 cDNA 。扩增对象为 DNA 聚合酶 mRNA 5 端 377bp 片段和复制酶 A mRNA 的 643bp 片段，两者都为中等丰度。 将 1/10 的 cDNA 合成反应产物使 用 Taq DNA 聚合酶扩增 30 个循环。为了防止痕量 RNase 的污染，从富含 RNase 的样品（如胰脏）中分离到的RNA 需要贮存在甲醛中以保存高质量的 RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星 期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存 3

8、 年仍保持稳定。 另外，长度大于 4kb 的转录本对于痕量RNase 的降解比小转录本更敏感。为了 增加贮存 RNA 样品的稳定性，可以将RNA 溶解在去离子的甲酰胺中，存于 -70。用于保存 RNA 的甲酰胺一定不能含有降解RNA 的杂物。来源于胰脏的 RNA 至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用 RNA 时，可以使用下列方法沉 淀 RNA：加入 NaCl 至 0.2M 及 4 倍体积的乙醇， 室温放置 3-5 分钟，10,000 g 离心 5 分钟。 在逆转录反应中经常加入RNase 抑制剂以增加 cDNA 合成的长 度和产量。 RNase 抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂

9、（如 DTT） 存在的条件下加入，因为cDNA 合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合 的可以降解 RNA 的 RNase 。 蛋白 RNase 抑制剂仅防止 RNase A ， B， C 对 RNA 的降解，并不能防止皮肤上的RNase ，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心 不要从手指上引入RNase。 使用无 RNaseH 活性（ RNaseH- ）的逆转录酶 逆转录酶催化 RNA 转化成 cDNA。不管是 M-MLV 还是 AMV ，在本身的聚合酶 活性之外，都具有内源 RNaseH 活性。RNaseH 活性同聚合酶活性相互竞争RNA 模板与 DNA 引物或 cDNA 延伸链间形成的杂

10、合链，并降解RNA：DNA 复合物 中的 RNA 链。被 RNaseH 活性所降解的 RNA 模板不能再作为合成cDNA 的有 效底物，降低了 cDNA 合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的 RNaseH 活性将会大有裨益。 SuperScript 逆转录酶， RNaseH- 的 MMLV 逆 转录酶及 ThermoScript 逆转录酶， RNaseH- 的 AMV，比 MMLV 和 AMV 得到 更多量和更多全长的cDNA（图 3） 。RT-PCR 灵敏度会受 cDNA 合成量的影响。 ThermoScript 比 AMV 的灵敏性强得多（图4）。RT-PCR 产物的大小受限于逆

11、 转录酶合成 cDNA 的能力，尤其是克隆较大的cDNA 时。同 MMLV 相比， SuperScrip 显著提高了长 RT-PCR 产物的产量（图 5）。RNaseH- 的逆转录 酶同时增加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的37-42的温度下进行。图 3 逆转录酶对 cDNA 第一链产量的影响 在建议的合成条件下， 使用 oligo(dT) 引物和 10Ci的 -PdCTP 。第一链的总 产量使用 TCA 沉淀法计算。全长cDNA 使用在碱性琼脂糖胶上将大小分类的条 带切除并计数的方法分析。图 4 逆转录酶对 RT-PCR 灵敏度的影响图 5 逆转录酶对长模板RT-PCR 灵 敏度的影响

12、以 oligo(dT) 为引物，使用 ThermoScript 或 AMV ，在 50下由 Hela 细胞总 RNA 合成 cDNA 。使用 Platinum? Taq DNA聚合酶和人 DNA 聚合酶 引物进 行 35 个循环。人 tuberous scherosis mRNA （5.3kb ）和人 DNA 聚合酶 mRNA的全长 cDNA 的合成由 SuperScript 和 MMLV 催化。利用 oligo(dT) 为引物，由 5g Hela细胞总 RNA 合成 cDNA 。样品使用 RNaseH 处理，然后 使用 ELONGASE? Enzyme Mix将 1/10 的 cDNA 合成

13、反应产物扩增35 个循环。RNaseH 产生的障碍 RNaseH 对第一链 cDNA 的影响。 RNaseH 在 cDNA 合成期间降解 RNA:DNA 复合体中的 RNA。红色箭头代表潜在的酶切位点。提高逆转录保温温度较高的保温温度有助于RNA 二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数 RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将 RNA 和引物在 65保温，然后迅速置于 冰上冷却， 可以消除大多数二级结构， 从而使引物可以结合。 然而某些模板仍然 会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用 ThermoScript 逆转录酶，并将逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增

14、（图 6）。较高的保温温度也可以增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物（GSP） 进行 cDNA 合成时（见第三章）。如果使用GSP，确保引物的 Tm 值与预计的 保温温度相同。不要在高于60时使用 oligo(dT) 和随机引物。随机引物需要在 增加到 60前在 25保温 10 分钟。除了使用较高的逆转录温度外，还可以通 过直接将 RNA/引物混合物从 65变性温度转到逆转录保温温度， 并加入预热的 2 的反应混合物提高特异性 （cDNA 热启动合成） 。这种方法有助于防止较低温 度时所发生的分子间碱基配对。 使用 PCR 仪可以简化 RT-PCR 所需的多种温度 切换。图 6 温度对不同模

15、板的影响 使用 ThermoScript 或 AMV ，以 18S rRNA 基因特异性引物，由10ng 大豆总 RNA 在所示温度合成 cDNA。 将1/10 的 cDNA 反应产物使用高保真Platinum Taq DNA 聚合酶进行 40 个 PCR 反应循环。 表 2. 逆转录保温温度Reverse Transcriptase Incubation Temperature AMV 37C-45 C M-MLV 37C SuperScript?II RT 37C-50 C ThermoScript? RT 42C -65 C RNA 在高于 65时开始水解，对于 1kb的 RNA 第一链

16、合成温度可以为70， 对于 1kb 的 RNA 则需要 65。 Tth 热稳定聚合酶在 Mg存在条件下作为 DNA 聚合酶，在 Mn存在条件下作为 RNA 聚合酶。它可以在最高 65条件下 保温。然而，PCR 过程中 Mn的存在会降低忠实性， 这使得 Tth 聚合酶不太适合用于高精确度的扩增，如cDNA 的克隆。另外， Tth 的逆转录效率较低，这会 降低灵敏度，而且，既然单个酶就可以进行逆转录和PCR，那么没有逆转录的 对照反应就不能用来将cDNA 的扩增产物同污染的基因组DNA 的扩增产物区分 开来。 促进逆转录的添加剂 包括甘油和 DMSO 在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的 稳定并解开 RNA 二级结构，最多可以加入 20的甘油或 10的 DMSO 而不影 响 SuperScript 或 MMLV 的活性。 AMV 也可以耐受最多20的甘油而不降低 活性。为了在 SuperScript 逆转录反应中最大限度提高RT-PCR 的灵敏度，可 以加入 10