昆虫杆状病毒载体

《昆虫杆状病毒载体》由会员分享，可在线阅读，更多相关《昆虫杆状病毒载体（30页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、昆虫杆状病毒表达系统昆虫杆状病毒表达系统高遄高遄 生物化学与分子生物生物化学与分子生物 21204222120422原核细胞系统 l大肠肠杆菌细细胞 操作简便 周期短、收益大 表达产物稳定 相对分子质量有限 不能对表达产物进行 一些翻译后加工 、修饰体外基因 表达系统真核细胞系统 l哺乳动动物细细胞 l酵母细细胞 l昆虫细细胞（杆状 病毒表达系统统） 独特特性前言前言高表达 低成本 安全性高 大规规模生产产前言v 昆虫杆状病毒表达系统统是目前国内外十分推崇的真核表达 系统统。利用杆状病毒结结构基因中多角体蛋白的强启动动子 构建的表达载载体，可使很多真核目的基因得到有效甚至高 水平的表达。 v

2、具有高效表达、基因克隆容量大、重组组病毒易于筛选筛选 、 安全性高、且有完备备的翻译译后加工修饰饰系统统等特点，现现 已成为为基因工程四大表达系统统之一。 v 利用该该表达系统获统获 得重组组蛋白可用于药药物开发发、疫苗生 产产、生物杀杀虫剂剂等多个领领域。据文献统计统计 ，已有1000 余种外源基因在昆虫杆状病毒表达系统统中得到了成功地表 达，其中约约有95% 的外源重组组蛋白能够够被正确的转译转译 后加工修饰饰，具有与天然蛋白相同的生物活性。昆虫杆状病毒昆虫杆状病毒表达系统表达系统2 2. .杆状病毒载体表达系统的特点杆状病毒载体表达系统的特点3.3.昆虫杆状病毒表达系统的应用昆虫杆状病毒

3、表达系统的应用1.1.昆虫杆状病毒表达系统的构成昆虫杆状病毒表达系统的构成4. 4. 参考文献参考文献1.1.昆虫杆状病毒表达系统的构成昆虫杆状病毒表达系统的构成1.1 杆状病毒载体1.2 昆虫细胞宿主表达体系1.1.昆虫杆状病毒表达系统的构成昆虫杆状病毒表达系统的构成表达过过程 1. 将外源目的基因插入到启动动子下游 2. 与杆状病毒重组组，获获得重组组病毒 3. 将重组组的病毒纯纯化 4. 感染昆虫细细胞或虫体 5. 外源基因随着病毒的复制而获获得表达1.1 1.1 杆状病毒载体杆状病毒载体v 1.1.1杆状病毒简简介 v 杆状病毒是研究细细胞分子生物学的重要工具，同时时也是外源基 因在昆

4、虫细细胞中表达的载载体。杆状病毒只来源于无脊椎动动物， 已发现发现 600多种杆状病毒，其中仅仅有不到20 种进进行了分子生 物学研究。 v 杆状病毒的基因组为单组为单 一闭闭合环环状双链链DNA 分子， 大小为为 80 160kb，其基因组组可在昆虫细细胞核复制和转录转录 。DNA 复制后组组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较较大的柔韧韧性，可 容纳较纳较 大片段的外源DNA 插入，因此是表达大片段DNA 的 理想载载体。其中, 用作外源基因表达载载体的杆状病毒，目前仅仅 限于核型多角体病毒( nuclear poly hedrosis virus, NPV) 。1.1 1.1 杆状病毒载体杆

5、状病毒载体v 现现已知基因组组全序列的杆状病毒仅仅有7 种: 苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒( AcMNPV ) 家蚕核多角体病毒( BmNPV ) 黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒( OpMNPV ) 舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒( LdMNPV ) 甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒( SeMNPV) 棉铃虫核型多角体病毒( HaNPV) 斜纹夜蛾核型多角体病毒( SpltMNPV) 1.1 1.1 杆状病毒载体杆状病毒载体v AcMNPV 是昆虫杆状病毒表达系统统中最常用的载载体，基因表达分为为4 个阶阶段: 立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因 表达。早于DNA 复制 病毒DNA

6、合成v 多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细细胞中的积积累可高达 30% 50%，是病毒复制非必需成分，但对对病毒粒子却有保护护作用， 可使之保持稳稳定和感染能力。 v P10 蛋白为为另一类类高效表达的极晚期蛋白，也是一类类病毒复制非必需成 分，可在细细胞中形成纤维纤维 状物质质，可能与细细胞溶解有关。理想的外源基 因插入位点1.1 1.1 杆状病毒载体杆状病毒载体v 载载体重组组原理：原理是人为为将杆状病毒多角体蛋白两翼序列 的同源序列引入含外源基因的质质粒载载体中，通过过同源重组组方 式来实现实现 外源基因对对病毒多角体蛋白基因的替换换。 v 由于杆状病毒分子质质量约为约为 1

7、34kb，不能利用多克隆位点（ 酶切连连接）进进行基因重组组，只能利用杆状病毒和带带有外源基 因的质质粒载载体进进行共转转染（转转移载载体的介导导）。 多克隆位点：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别 位点。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。 共转染：物理上不相连的基因被整合到同一整合序列并在同一转染细胞内表达 的现象。1.1 1.1 杆状病毒载体杆状病毒载体1.1.2杆状病毒载载体的重组组 将极晚期基因( 如多角体基因及其边边界区) 克隆入细细菌的质质粒 中 消除其编码编码 区和不合适的酶切位点 保留其5c端对对高效表达必需的调调控区 在下游引入合适的酶切位

8、点供外源基因的插入，即得到转转移载载 体。 将要表达的外源基因插入其启动动子下游 与野生型AcNPV DNA 共转转染昆虫细细胞 通过过两侧侧同源边边界区在体内发发生同源重组组，使多角体蛋白基 因被外源基因取代。1.1 1.1 杆状病毒载体杆状病毒载体1.1.3杆状病毒载载体的筛选筛选 v 由于多角体基因被破坏，则则不能形成多角体。这这种表型在进进 行常规规空斑测测定时时，可同野生型具有多角体的病毒空斑区别别 开来， 这这就是最初的筛选筛选 重组组病毒的方式。 v 由于重组组效率较较低( 0. 1% 1%) ，表型差别别不显显著，应应 用上有一定的困难难。1.1 1.1 杆状病毒载体杆状病毒载

9、体1.1.3杆状病毒载载体的筛选筛选 v 为为此，经过经过 不断探索，在重组组杆状病毒的筛选筛选 与鉴鉴定方面取 得了很大改进进。 v 具体方法有以下几种： 1. -半乳糖苷酶的蓝蓝白筛选筛选 2. 体外酶促定位重组组 3. Bacmid 4. TK 基因 5. Neo 基因BacmidBacmidv Luckow 等开发发。快速、高效产产生重组组AcMNPV 病毒。 取杆状病毒( baculovirus) 和质质粒( plasmid) 的英文字 头头字尾命名为为Bacmid，即杆状病毒质质粒之意。 v 根据F因子载载体原理，用类类似于酵母体内重组组的方法，构建 了一种新杆状病毒穿梭载载体Ba

10、cmid。该载该载 体可像质质粒一样样 在大肠肠杆菌中生长长，又对鳞对鳞 翅目昆虫细细胞具有感染性。 v Bacmid 含有F因子复制子( 可在大肠肠杆菌中复制) 、卡那 霉素抗性基因及Tn7 转转座位点attTn7。 v 转转移载载体中，外源基因置于杆状病毒启动动子之下, 两端分别别 为为Tn7的左右端。以其转转化含Bacmid的E.coli菌株，由辅辅 助质质粒提供反式作用发发生转转座，而将外源基因转转到Bacmid 的attTn7位置。BacmidBacmidv在Bacmid 中，外源基因被核多角体启动动子控制， 并包含了多种抗性基因及LacZ 缺失标记标记 ，极大地 方便了重组组病毒的

11、筛选筛选 及鉴鉴定。这这种重组组了外源基 因的Bacmid转转染的昆虫细细胞，可得到100%阳性 重组组病毒 。 v操作简单简单 方便，只需1 周即可完成重组组病毒载载体的 构建。BacmidBacmidv 由于我国有养蚕业业，还还可在AcMNPV Bac-to-Bac表达 系统统的基础础上进进行改造，构建能够应够应 用于家蚕的BmNPV Bac-to-Bac 表达系统统，这这将大大减少传统传统 昆虫杆状病毒 表达系统统表达外源重组组蛋白所需时间时间 ，极大地提高了工作 效率。还还能够够解决培养昆虫细细胞成本高，难难于规规模化生产产 等问题问题 。 v 重组组率100%、操作简简便、1 周完成

12、重组组、全部操作都在 细细菌中进进行，取名为为Bac-to-Bac 表达系统统1.2 昆虫细细胞宿主v 昆虫细细胞在生物学、医学、农业农业 等领领域中被作为为非常重要的 研究工具。 v 目前全世界建立的昆虫细细胞系有800 多株，分别别来源于鳞鳞翅 目、双翅目、鞘翅目、蜚蠊目、直翅目、膜翅目、同翅目和半 翅目8 个目的170 余种昆虫，其中具有实际应实际应 用的细细胞系大 部分来自鳞鳞翅目和双翅目。 v 以昆虫杆状病毒为载为载 体的昆虫细细胞可成功、高效地表达外源 基因，生产产具有重要药药用价值值和具备备天然活性的重组组蛋白。 因此，在众多昆虫细细胞系中鳞鳞翅目昆虫细细胞系应应用最为为广泛 。

13、1.2 昆虫细细胞宿主v 昆虫杆状病毒表达系统统既可在昆虫培养细细胞中，又可在昆虫 和蛹内进进行表达。究竟在昆虫体内还还是在培养细细胞中表达外 源基因，可根据外源蛋白的性质质及其用途、表达水平高低、 分离纯纯化难难易、纯纯化要求高低等因素来考虑虑。 v 然而，对对于常规规小量及高纯纯度的蛋白质质生产产而言，利用体外 培养的昆虫细细胞来进进行表达是首选选途径。 v 相对对于已知的上百万种昆虫以及昆虫细细胞系的广泛用途来说说 ，已经经建立的细细胞系还远远还远远 不够够，仍需建立更多的昆虫细细胞 系以满满足实际实际 需要。Company Logo2.2.杆状病毒载体表达系统的特点杆状病毒载体表达系统

14、的特点安全性高基因容量大表达水平高能进进行翻译译后的加工修饰饰重组组蛋白具有完整的生物学功能2.2.杆状病毒载体表达系统的特点杆状病毒载体表达系统的特点相对对其他表达系统统它具有以下几个方面的特点： 重组组蛋白具有完整的生物学功能：杆状病毒表达系统统可为为高 表达的外源蛋白在细细胞内进进行正确折叠、二硫键键的搭配及寡聚 物的形成提供良好的环环境，可使表达产产物在结结构及功能上接近 天然蛋白。利用昆虫杆状病毒表达系统来表达富含二硫键的一些具有神 经毒性的生物毒素肽将是一个最佳的选择。2.2.杆状病毒载体表达系统的特点杆状病毒载体表达系统的特点能进进行翻译译后的加工修饰饰：杆状病毒表达系统统具有对

15、对蛋白质质 完整的翻译译后加工能力，包括糖基化、磷酸化、酰酰基化、信号 肽肽切除及肽肽段的切割和分解等，修饰饰的位点与天然蛋白在细细胞 内的情况完全一致。对比实验证 明，在昆虫细胞发生的糖基化位点与哺乳动物 细胞中完全一致，但修饰的寡糖种类却不完全一样。这种不一 致对不同目的蛋白的活性影响不同，所以昆虫表达系统还可作 为一个研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方面的理想模型。2.2.杆状病毒载体表达系统的特点杆状病毒载体表达系统的特点表达水平高：与其它真核表达系统统相比较较，此系统统最突出的 特点就是能获获得重组组蛋白高水平的表达，最高可使目的蛋白的量 达到细细胞总总蛋白的50。虽然目前科研工作者

16、大都是在细胞培养条件下进行表达外源基因，当条件成熟时 需要大量制备某类外源蛋白时，最好采用昆虫幼虫或蛹。因为培养昆虫幼虫和蛹远比 培养细胞简单、廉价，而且利用昆虫幼虫或蛹能够显著提高外源基因的表达水平。 利用BmNPV 载体在家蚕幼虫中成功表达出重组蜘蛛牵引丝蛋白，表达量高达每 个昆虫活体6mg。一般在幼虫体内的淋巴液中，蛋白质表达量较在细胞培养基中高 10倍以上。因此，通过昆虫杆状病毒表达系统可利用昆虫活体大规模生产各种重组 蛋白。2.2.杆状病毒载体表达系统的特点杆状病毒载体表达系统的特点基因容量大：昆虫杆状病毒的基因组为单组为单 一闭闭合环环状双链链 DNA分子，大小为为80 200kb，其基因组组可在昆虫细细胞核 中复制和转录转录 。DNA 复制后组组装在杆状病毒的毒粒内，由于毒 粒具有较较大的柔韧韧性，能包装较较大的基因片段，可表达非常大( 100kb) 的外源性基因。因此是表达大片段DN