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1、结核病的研究进展概 况l 结核病是仅次于爱滋病的第二大感染性疾病 。由于许多爱滋病死于结核，故在单一感染死因 中，结核病仍居首位。自从在全球范围内开展 DOTS以来，结核病的感染率、病死率及细菌耐 药情况均有降低，但因各国具体实施状况存在很 大差异，所以改善的速度十分缓慢，与预期目标 相距甚远。对于全球结核病防治前景，许多专家 并不表示乐观。控制结核病的基本条件l及早发现，快速诊断和及时治疗 l疾病发现率达到70%，有赖于广泛疾病普 查l治疗成功率85% ，有赖于DOTS这样结核病才能得到有效控制，每年 递减率才能达到10%左右，如此高质量防治 数十年后，结核发病率才会显著降低。 我国结核病疫
2、情特点l感染人口基数大，患病人数多，传染源多 ； l发现率低，平均只有26% ；DOTS覆盖率低 ；l 耐药患者多，WTO公布的耐药检测报告中 ，我国在特别警示国家和地区中名列第一；l高危发病人群增多，如老年人群、糖尿病 、AIDS等。 基础研究：Th1型/Th2细胞因子失衡 lT细胞在结核病免疫中的关键作用:细胞免疫反应功能低下者是结核病的高危人群，而体液免疫功 能低下者如多发性骨髓瘤，并不是结核病易感者 。l其中CD4+T细胞发挥了主导作用。Th1和Th2为两种功能不同的CD4+T细胞亚群，其分泌的细胞因 子（CK）各不相同。 基础研究：Th1型/Th2细胞因子失衡l许多研究证实，结核免疫
3、是由以灭菌为核心的 保护性免疫反应和以组织坏死为特征的免疫病理 反应构成的，并由不同的结核抗原激发。l保护性免疫反应是由保护性抗原活化的Th1细胞介导的巨噬细胞非特异性抗菌活性来完成的。 Th1型CK主要有IFN，IL-12，lL-18D等。实验 表明，敲出IL-12或IL-18基因，可使小鼠的结核 杆菌的易感性明显增高； 基础研究：Th1型/Th2细胞因子失衡l由病原性抗原活化的Th2细胞则介导以TDTH细胞（迟发超敏反应性T细胞）为效应细胞的病理性免疫反应，并导致特征性 组织坏死，Th2型CK主要有IL-4、IL-10、IL-13等。实验表明IL-10和IL-13均能抑制巨噬细胞杀灭结核杆
4、菌的能力；小鼠敲除IL-10基因后可更快消除结核杆菌。 基础研究：Th1型/Th2细胞因子失衡l据报道，机体感染结核杆菌后，Th1型CK反应 超过Th2型CK反应达20倍时，可建立潜伏期感染 ，表明Th1型CK反应在抑制结核菌生长繁殖中发 挥重要作用。 l临床实验表明，活动性肺结核患者外周血单个 核细胞经结核抗原刺激后IFN-产生明显减少， IFN-基因无表达，而IL-10产生明显增加。但经 两个月抗痨治疗后随着病情好转IL-12产量明显升 高。 基础研究：Th1型/Th2细胞因子失衡lCondos等发现，涂片阴性非空洞性肺结核患者局部免疫反应以Th1优势为特征，BALF中IFN-分泌明显增高
5、;而涂片阳性空洞性肺结核患者局部则以单核细胞和巨噬细胞为主，IFN-产生减少, 但随着抗痨治疗后临床症状改善，IFN-分泌细胞重新聚集到肺部。 基础研究：Th1型/Th2细胞因子失衡由此可见 ：lTh1型CK主要激活巨噬细胞，增强其杀菌能力 ，从而在结核感染中发挥保护性免疫作用。 lTh2型CK则抑制Th1型CK和IFN-的产生，降低巨噬细胞杀灭结核菌的能力，从而削弱结核免 疫应答，与结核感染的进展、持续化和慢性化有 关。 基础研究：Th1型/Th2细胞因子失衡lTh1型/Th2型CK的动态平衡是机体有效 控制结核感染的根本保证，这种平衡一旦 被打破，将导致结核病的发生和发展。基础研究：结核杆
6、菌基因组学 l 结核杆菌的全基因组测序工作已完成，共含441万个碱基对，约4000个基因，3924个开放阅读框架。其中大部分用于编码脂类代谢酶；10%编码两类不相关的酸性蛋白，可能与产生抗原变 异和逃逸免疫有关。约40%有功能，44%可能有功能，16%称为孤儿蛋白。 结核杆菌基因组学：耐药基因研究 在结核菌耐药基因研究中，近来发现 ：l约90%95%的耐利福平菌株有rpoB基因突变 ； l约47%58%耐药异烟肼菌株有katG基因突变 ，其余则inhA基因或ahpC基因突变； l耐乙胺丁醇菌株与embA、embB基因突变有关 ；l约72%耐吡嗪酰胺菌株与编码PZA酶的pncA基 因突变有关。基
7、础研究：结核杆菌蛋白质组学 l Jumy等对有毒结核菌株与无毒BCG进行 比较蛋白质组学研究，发现有两种蛋白质 仅在有毒菌株中高度表达，菌种内变异非 常小，有可能成为结核病早期诊断的分子 标志。基础研究：结核杆菌蛋白质组学lBahk等采用比较蛋白质组学研究方法发现有两 种蛋白质RRV369和RRV3874在结核杆菌中含量较高。然后采用联合酶联免疫吸附试验，对肺结 核患者和健康人血清各100份进行检测，结果显 示RRV369和RRV3874诊断肺结核的敏感性分别 为74%和60%，特异性为97%和96%，有望成为 肺结核早期诊断的分子标志物。 基础研究：结核杆菌蛋白质组学lTuny等比对耐异烟肼
8、菌株和敏感株的蛋白质组学差异，检测出了与异烟肼抗药性有关的蛋白。l现在国际上已建立结核杆菌蛋白质组学跨国合 作研究体系，计划在5年内阐明结核杆菌相关蛋白的结构和功能，这将大大促进结核发病机制、抗痨治疗新靶点及新型疫苗的研究。基础研究：细胞凋亡与结核病 l结核病时巨噬细胞适度凋亡是一种免疫保护机 制，可使结核杆菌丧失原有生存环境，导致细菌 活力降低，也可清除炎症部位的感染细胞。l吞噬结核杆菌的巨噬细胞发生凋亡后，细菌被 包埋在凋亡小体内，又被循环单核细胞吞噬，这 样可能会触发更为有效的细胞内杀菌机制。l细胞凋亡还可抑制结核杆菌繁殖，防止结核感 染播散。 基础研究：细胞凋亡与结核病 国外研究发现：
9、l线粒体膜结构的完整即线粒体渗透性转换（ MPT）稳定，caspase激活降低和线粒体细胞色 素C释放减少是巨噬细胞发生凋亡的标志，也是 有效控制结核杆菌感染的特征。l线粒体膜完整性受损（MPT降低），caspase 激活增加和线粒体细胞色素C释放增加是细胞坏 死的表现，并造成无法控制的结核杆菌生长与繁 殖。 基础研究：细胞凋亡与结核病Hirsch等研究发现：l活动性结核病患者CD4+和非CD4+T细胞自发凋 亡以及结核杆菌诱导的凋亡发生率显著高于健康 者，T细胞凋亡发生率与T细胞反应呈负相关，即 凋亡率越高则IFN-、IL-2水平越低。l经有效抗痨治疗后，自发的与结核杆菌诱导的 凋亡发生率均
10、下降50%，IFN-、IL-2水平升高3 8倍，这表明T细胞过度凋亡削弱了机体的抗结 核免疫机制，与结核病发生和发展有关。实验室诊断：病原学 抗酸染色和培养：l痰涂片检出率（抗酸染色）约30%40%，痰中菌量 必须多于5106/L才能检出；集菌法敏感性可达60% 70%，与标本质量、检测者技术与责任心有关，但无法 区分结核杆菌和非结核杆菌。l国外报道，在痰标本中加入特殊荧光素作标记，可在 荧光显微镜下进行区分。l结核杆菌快速培养系统目前普遍采用MCIG和 BACTEC，速度明显高于传统方法，平均9天可判定结 果，缺点是放射污染率稍高。近来研制出一种快速变色 培养基，敏感性与培养速度与之相当，且
11、污染率低。 6实验室诊断：病原学 噬菌体生物扩增法：分枝杆菌噬菌体是一种DNA病毒， 只能感染相应的活分枝杆菌。噬菌体增殖 周期速度快，在几分钟几十分钟不等， 利用这些特性可用于结核杆菌的快速检测 及药敏测定。 病原学诊断：噬菌体生物扩增法 近些年来国内外对此法进行了大量研究，认为 有以下优点：l 简便快速，操作简单，不含特殊仪器，检测标 本仅需48小时可得到结果。l灵敏特异，敏感度为200300条/毫升。l安全可靠，该法将活体菌裂解杀灭，传染性小l价廉 病原学诊断：噬菌体生物扩增法但此种方法也存在很多问题：l与某些非结核分枝杆菌有交叉反应。l敏感度仍不够高，一般在7595%之间，且与痰菌含量
12、 有关，痰涂阳+为63.9%，+为71.97%，+为88.2%。l操作影响因素多：需设立多种对照，以保证可靠性，且 反应时间、温度、噬菌体活性含量及特异性、杀毒剂的浓 度及混匀情况等均可影响检测结果。l 蛭弧菌感染：蛭弧菌是一种与噬菌体极其相似的寄生微 生物，可在活菌和死菌中增殖，裂解细菌后可产生菌斑， 可造成假阳性，在操作中须避免污染。 病原学诊断：噬菌体生物扩增法l该法若要广泛用于临床，仍有大量工作必须完成：a. 筛 选出结核杆菌特异性高的噬菌体；b.试剂盒及检测方法的标准化。l该法亦可用于结核杆菌药敏测定，但与常规药敏检测结 果存在一定差异，须进一步研究明确其原因。近来美国学 者构建了一
13、种含荧光素酶基因的噬菌体，可用于多种一线 抗结核药物的敏感性测定，并且一次可进行大量标本的检 查，是迄今最快的药敏试验，今后须对该法进行标准化研 究。 病原学：分子生物学诊断 l PCR：PCR技术并不复杂，但要求标准化试剂盒，严格的技术质量控制和较高的实验条件。经过多年努力，该方法不断完善，并开发出新的 PCR技术，如实时荧光PCR、酶联PCR等，转录PCR等。但在临床上还存在一些问题，如不能区分活菌和死菌，存在结核杆菌滞后现象等。病原学：分子生物学诊断lDNA序列测定：该技术具有很高的分辨率，可快速、灵敏、可靠地测定结核杆菌的特异性核 苷酸序列和突变耐药基因。目前已有自动化DNA测序仪，但
14、价格昂贵，难以推广。但随着该技术成熟、改进和完善，可望得以广泛应用。病原学：分子生物学诊断lDNA探针技术：目前已有商业性试剂盒应市 ，但用于痰标本的检测结果不十分理想，主要缺 点是敏感度性不高，标本中菌量需1010/L DNA 才能检测出来，需依赖于培养，并且只能鉴别少 数几种结核杆菌。但随着结核杆菌全基因测序的 完成，该技术研究正在突飞猛进，特别是将特异 性强的核酸探针技术与敏感度性高的PCR技术相 结合，已成为目前结核病诊断研究的热点。病原学：分子生物学诊断l生物芯片技术：该技术具有高效、微型化、自动化、防污染、成本低等特点，分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片，随着结核杆菌基因
15、计划的推进及蛋白组学研究的深入，可望在不久的将来，该技术将对结核病基础研究、病原学诊断等多方面产生巨大影响。病原学：结核杆菌抗原测定l结核杆菌抗原测定：38KD蛋白是结核杆菌的主要免疫原，有学者采用酶联免疫法检测结核患者痰液、胸水及脑脊液中的该抗原，最低检出量可达到5g/L，有较好的敏感性，但尚需进行大标本研究。血清学诊断 l 血清学诊断简便快捷，是结核病诊断的百年追 求。l主要方法是测定血清和组织液中的特异性抗结 核抗体，故结核抗原的选择至关重要。l目前多采用PPD，但其所含抗原为致病性分枝 杆菌、非致病性分枝杆菌和卡介苗（BCG）所共 用，故PPD抗体阳性不能区分是分枝杆菌感染（ 致病性或
16、非致病性）或是接种BCG的结果。 血清学诊断l目前发现了一些结核菌蛋白如38KD蛋白 ，BCG对其合成受到抑制，故可区分结核 病患者与BCG接种阳性者，具有较好的特 异性（94.9%），在菌阳患者中敏感性尚可 （76%以上），但菌阴患者的敏感性较低 （仅37.7%）是其缺点。 血清学诊断l14KD蛋白、18KD蛋白、MPT64、ESAT-6，以及脂阿拉伯甘露糖抗原等，特异性均较PPD抗原有所提高，可达78.6100%，但敏感性不高，各家报道差异很大，在31.7%94%之间，临床应用价值评价不一，故尚难成为结核病的确诊指标 ， 血清学诊断l目前认为该法对肺外结核的诊断有一定价值。关键仍在于寻找免疫原性和特异性均强的结核抗原，以及统一、规范、稳定的实验条件和试剂。l联合应用多种抗原可以提高特异性抗体检测的敏感度。皮肤试验 l目前除OT和PPD外，近来有学者用特异性较强的ESAT抗原，可区分结核杆菌感染和BCG接种阳性者，但仍不能区分活动性结核病和隐性结核感染，故不能作为结核病确诊方法。影象学诊断 l目前肺部疾病的影象学诊断
