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1、浙 江 省 疾 病 预 防 控 制 中 心炭疽实验室检测技术浙江省疾病预防控控中心微生物检验所 20120830炭疽的定义及病原体v炭疽（anthrax）是由炭疽芽孢杆菌引起的人兽 共患性传染病，因其形成一种特征性的皮肤炭样 焦痂而得名。 v炭疽主要发生于畜间，以牛、羊、马等食草动物 最为易感。人类偶然从病畜及其产品受到感染。 v炭疽芽孢杆菌有耐力极强的芽孢，在空气、土壤 、尘埃、污染的皮毛、肉类中广泛存在。以皮肤 直接接触病畜及其皮毛、排泄物最易感染，引起 皮肤炭疽，占95%以上的病例。吸入含大量芽孢 的尘埃及食用染菌肉类，可分别发生肺炭疽及肠 炭疽。 v由于炭疽芽孢在环境中的抵抗力极强，在
2、 军事方面，一直被列为是头号生物战剂， 美国、前苏联和伊拉克对其武器化研究较 多，2001年美国出现的炭疽芽孢杆菌生物 恐怖事件也说明了该菌芽孢的威胁性。无 论是生物战的使用，还是作为生物恐怖手 段，快速检验和鉴定炭疽芽孢杆菌是最为 关键的。炭疽杆菌的发现v炭疽杆菌是人类历史上第一个被发现的病原菌。 1850年，Rayer于感染绵羊血中发现了炭疽杆 菌，1876年微生物学的先驱、著名的德国微生 物学家柯赫(Robert Koch)首次应用人工培养 基分离培养成功，发现其可形成内孢子体，注射 动物后可导致实验性炭疽。从而证明了炭疽杆菌 是炭疽的病原菌 ，并第一次在显微镜下显示炭疽 杆菌成链杆状排
3、列，菌体两端平截，可形成芽孢 等形态学特征。病原学v炭疽芽胞杆菌：属于芽孢杆菌科需氧芽胞杆菌属 群I中菌体在0.9m以上的一族。其中包括炭疽杆 菌、腊样杆菌、苏云金杆菌、巨大杆菌等各种。 v炭疽芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的16S rRNA 序列完 全一致，而23S rRNA 序列中仅有两个核苷酸的差 异。 v炭疽芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌 和蕈状芽胞杆菌彼此之间非常相似，人们给予它 们一个非正式的称呼:“蜡样芽孢杆菌群”。v一些进化研究学者推论,这几种细菌来源于同一个 祖先,为了适应不同的环境而产生分化,炭疽芽孢 杆菌成为温血动物的病原菌,蕈状芽孢杆菌是环境 中的正常菌,对人和动物没有
4、致病能力;而蜡样芽 孢杆菌和苏云金芽孢杆菌处于以上两种菌之间,蜡 样芽孢杆菌是环境中的常见菌,偶尔也会使温血动 物感染;苏云金芽孢杆菌则成为昆虫的致病菌。 v但毒素原性、致病特性和质粒基因有严格的差别 ，表明炭疽芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、苏云金芽 胞杆菌应该作为各自独立的种。v炭疽杆菌为革兰阳性杆菌。大小为(1 3)m(510)m，单个或35个链状。有 芽孢，无鞭毛，不运动。血液培养中可形成菌膜 。普通琼脂培养菌落灰白，不透明，大而扁平， 表面干燥。麦康凯培养不生长。 炭疽芽胞杆菌l革兰阳性 l棒状杆菌 l需氧兼性厌氧 l可形成芽胞 l链状生长 l环状染色体 l2个大质粒培养特性 v 需氧或兼性
5、厌氧，生 长的最适pH值是59 ，温度为34-36 。 v 炭疽杆菌营养需求很 低，在普通琼脂培养 基上生长良好，菌落 灰白色，表面干燥， 稍隆起，边缘不整齐 ，放大可见菌落有花 纹，呈卷发状。在肉汤中生长呈絮状 沉淀血平板上不产生溶血环革兰染色阳性芽胞染色荚膜染色生化实验葡 萄 糖麦 芽 糖蔗 糖乳 糖甘 露 醇水 杨 素M RV P石蕊牛乳+产酸，液 化迟缓产酸不产气 不产生靛 基质和 H2S毒力v毒力：本菌毒力主要与荚膜和毒素有关，荚膜和 毒素分别由pXO1和pXO2质粒调控。 v1993年，Fadyean首次描述了炭疽杆菌的荚膜 。荚膜是D-谷氨酸的多聚物，多聚谷氨酸链在体 外分子量为
6、2050 kD，在体内为215 kD。控 制荚膜的合成与降解的基因位于pXO2上。 v1955年，Smith和他的同事通过过滤炭疽杆菌 感染的豚鼠的血清，首次证明了炭疽毒素的存在 。抗原v菌体抗原：耐热多糖类物质，缺乏种特异性，为 非保护性抗原，免疫动物可产生沉淀素抗体，用 于Ascoli热沉淀反应试验。 v芽胞抗原：抗原性基本与菌体相同。 v荚膜抗原：为多聚D-谷氨酸，非保护性抗原，有 抗吞噬作用，与毒力有关，是重要的致病因子。v毒素抗原：毒素由三个蛋白组成：保护性抗原 (PA)、致死因子(LF)、水肿因子(EF)，组成两种 毒素：致死毒素(LT, PA+LF)和水肿毒素(ET, PA+EF
7、)，在炭疽芽胞杆菌的致病过程中具有重要 作用。对PA 的研究非常广泛，已经证明PA是机体 产生保护性抗体的重要抗原，也是现今无细胞疫 苗的主要成分。v在致病时，炭疽毒素的单一成分不能发挥 作用，水肿因子或致死因子必须与保护性 抗原结合成水肿毒素或致死毒素才具有活 性。当PA与EF结合，能使豚鼠、家兔的皮 肤引起局部水肿，PA与LF结合，能使小鼠 、大鼠及猴致死。诊 断v流行病学线索，临床表现，实验室检查。WS283-2008炭疽诊断标准：v在临床标本中涂片镜检，发现革兰阳性大杆菌。临床诊断v从临床标本中分离出炭疽芽胞杆菌。确诊v双份血清抗体滴度出现四倍升高。确诊炭疽实验室诊断程序标本种类v新鲜
8、病患标本：血液、组织、皮肤水肿液，痰液、鼻腔拭子、排泄物、脑脊液。v血液标本应在急性期和恢复期采取双份留取血清。v陈旧标本：腐烂标本、动物产品，皮、骨、掩埋的脏器、干血块。v外环境标本：可疑污染的土壤、污水、空气。标本采集方法v 病人采样：皮肤炭疽可采局部渗出液，用灭菌棉拭子涂擦 后接种培养基；肠型炭疽可采粪便；肺型炭疽可采上呼吸 道粘膜拭子接种，以及采取痰液标本；各型病例都应采取 血液标本。尽可能在抗生素治疗前采取标本。v 尸体采样：炭疽死亡动物可取自然孔流出的血液，羊可剪 耳根静脉，猪可剪尾静脉，人和动物尸检时，可穿刺采取 肝脾、肿大淋巴、水肿液、脑脊液，进行细菌培养。除必要时并在具备操作
9、细菌条件的实验室内，不得用解剖的方式获取标本。所需的血液与组织标 本，均应以穿刺方式取得。v外环境采样：污染水源采样，可用抽滤法，培养 滤膜；污染土壤采样，可用加热处理，再经漂浮 法培养；空气采样，可用空气采样器，最少每次 采300L，抽滤后进行培养。v生物战中气溶胶释放后，对污染区人或动物的采 样，采集鼻腔内、面部、头发的样品最为重要。 v从临床患者和病畜标本中分离炭疽芽孢杆菌是比较简便的。但从环境样品中分离和鉴定芽孢则 相对较困难，主要是缺乏有效的富集方法，环境 样品中含有其它形成芽孢的需氧菌,它们的过度生 长可干扰芽孢发芽或干扰检测。样品处理v芽孢的如下特性有利于芽孢从环境样品中的分 离
10、: 芽孢耐热: 样品前处理时可以加热63 65 20 min 杀死大部分繁殖体，并促进芽孢发芽 ；芽孢耐乙醇:样品前处理时可以用50 %乙醇处 理1 min 杀死大部分繁殖体，因此从环境样品中 分离芽孢并不受细菌繁殖体污染的干扰； 芽孢的浮力较大:可以用蔗糖或双相甘油2水分 离芽孢。细菌鉴定v 包括： v 显微镜检查：菌落形态、涂片染色、芽孢、荚膜； v 菌落形态； v 细菌形态； v 荚膜检查； v 串珠试验； v 噬菌体裂解试验(AP631)； v 青霉素抑制试验（10u/ml）； v 溶血性试验(血平板上不溶血)涂片染色镜检v 所有来自病人或尸体的标 本，都应首先立即涂片， 革兰氏染色，
11、进行显微镜 检查。发现大量两端平齐 的革兰阳性大杆菌，即可 作出临床诊断。分离培养 噬菌体裂解和青霉素敏感性试验标本处理： 在正常情况下应当无菌的标 本，如血液或脑脊液，直接 涂布营养琼脂平板。所有污 染的和陈旧的标本，均应首 先制成悬液，沸水浴加热15分钟后涂布平板。 挑选可疑菌落： 上述平板在37孵育8-24小时后，检查是否长出可疑的 炭疽芽胞杆菌菌落。菌株保存和运输菌种保存v50%甘油液保存：4保存。v半固体保存：4保存。v菌种保存管保存：-80保存。菌株运输v卫生部可感染人类的高致病性病原微生物菌（ 毒）种或样本运输管理规定核酸检测技术用核酸分析技术检测具有如下优点: v 特异性强；
12、v检测核酸成分比检测活微生物本身危险性小； 分析速度快； v可以快速灭活标本中的病原菌，用于核酸分析 。 v目前针对炭疽芽孢杆菌及其芽孢的核酸检测多 数都依赖于PCR ,有定性和定量PCR 的应用报道,PCR检测引物的设计v炭疽芽孢杆菌的PCR 检测中引物的设计非常关键 。 v炭疽芽孢杆菌有两个毒力相关质粒pX01 和pX02 。pX01 分子量为110 MDa (185kb) ，携带 cya 、lef 和pag 基因，分别编码水肿因子( EF) 、致死因子(L F) 和保护性抗原( PA) ； vpX02 分子量为60 MDa(95kb)，携带capABC 和dep 基因，分别编码荚膜与参与
13、其生物合成的 酶。v减毒疫苗株多为cap + / tox -或cap - / tox + ,大部分Pasteur 株为pX01 - / pX02 + (少数两种质粒都有)，Sterne 株为pX01 + / pX02 - 。 v自然界中也发现了pX01 + / pX02 - 突变株,尚 未发现pX01 - / pX02 + 突变株。 v因此，以质粒基因为模板设计引物时，一定要设 计两对以上针对不同质粒基因的引物才能保证不 漏检。v也有研究发现土壤中可能存在至少一种与CapB 和CapC 基因同源的细菌基因。因此，用CapB 和CapC 基因为靶序列的PCR 检测环境样品阳性 时的评价要谨慎。v
14、染色体上的一些基因和DNA 片段，如rpoB 基 因、Sap 基因、vrrA 基因、SG2850 片段和 Ba813 DNA片断,均有用于引物设计的报道。 vrpoB 基因编码RNA 聚合酶亚单位，在细菌进 化中该基因比较保守，在细菌染色体中至少有一 个拷贝，该基因在细菌代谢中起着重要作用。vQi 等比较了不同炭疽芽孢杆菌和其它芽孢杆菌的 rpoB 基因，设计了炭疽芽孢杆菌的特异引物， 实验结果表明，该引物只与一种非炭疽芽孢杆菌( 芽孢杆菌Ba813211 株) 交叉，是目前为止染色 体基因中炭疽芽孢杆菌特异性强最强的一对引物 。PCR检测样品处理标本处理：v 煮沸法：取少量标本加入适量缓冲液
15、或纯水中，100煮沸10-20分钟，取上清液做模板进行PCR反应。如为纯菌，则加热后需用0.22m滤器过滤后使用。v DNA提取：炭疽PCR检测主要是检测毒力相关基因，这些基因主要存在于质粒上，因此可只提取质粒DNA，一般使用市售试剂盒提取，方便、快速。PCR检测引物序列v pagA F: 5 ATT TGC GGT AAC ACT TCA CT 3v pagA R: 5 AGA CCG TGA CAA TGA TGG AA 3v cap外F：5 CCT GGT TGT TCT TTT CGT TGC 3v cap外R：5 CGG ATT GTA TAT GGA GTG GG 3v cap内F：5 TTT CAC CAG CAC CCA CAT AG 3v cap内R：5 GGG ACA GGA ATG TTT GGA TC 3v rpoB 2F：5 CCA ACA GTA GAA ATG CC 3v rpoB 2R：5 AAT TTC ACC AGT TTC TGG ATC T 3PCR反应体系10反应缓冲液 2.5 l v 4dNTP混合物（每种2.5mM）2l v 引物（上游10m） 1l v 引物（下游10m ） 1l v 待测模板 1l v Taq DNA 聚合酶 1 v 无菌去离子水 补足25l
