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1、抗体生成细胞检测溶血空斑实验微生物与免疫教研室实验目的掌握溶血空斑试验检测原理 掌握溶血空斑的操作方法实验原理溶血空斑实验（plaque forming cell assay,PFC ） 体外检测单个抗体形成细胞（B淋巴细胞） 的一种方法。 其原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔或小 鼠，取家兔淋巴结或小鼠脾细胞制成细胞悬液 ，与一定量的SRBC结合，在37条件下免疫活 性淋巴细胞释放出溶血素，在补体的参与下， 可溶解周围的绵羊红细胞，从而在每个抗体形 成细胞周围形成一个可见的溶血空斑。一个空斑代表一个抗体形成细胞（即B 细胞 ），空斑的数量反映机体的体 液免疫功能。 空斑大小表示抗体生成细
2、胞产生抗体 的多少。由于溶血空斑试验具有特异 性高，筛选力强，可直接观察等优点 ，故可用做判定免疫功能的指标，观 察免疫应答的动力学变化，并可进行 抗体种类及亚类的研究。 实验材料与试剂 器材：平皿、37水浴箱、离心机、显 微镜 试剂： SRBC悬液：取无菌脱纤维羊血，用NS或 PBS离心洗涤3次，每次以2000rpm，5min ，用PH7.2的PBS（含Ca2+、Mg2+）悬成细 胞浓度为2.00109个/mLHanks液（含Ca2+、Mg2+ ） 底层基（1.4%）和表层基（0.7% ） ：将琼脂糖用Hanks液配成1.4%和 0.7%两种浓度。将表层基分装于小试 管中，每管2ml 补体：
3、新鲜豚鼠血清 小牛血清：56灭活 30min实验步骤 免疫脾细胞悬液的制备 小鼠免疫：每只小鼠经尾静脉注入上述SRBC 悬液2.00104个/0.2ml或者腹腔注射4.00108 个/1ml。 单个脾细胞悬液的制备：将免疫后第四天的 小鼠拉颈处死，解剖取出脾脏，放入PH7.2 的PBS中漂洗，去掉结缔组织，加入适量的 PBS，用镊子挤压脾脏，稍静置，吸上清液 至离心管中，2500r/min离心5min，弃上清 后，定量加入PBS液1ml，混匀，再用PBS液 稀释10倍（浓度约为5106个/ml）（二）倾注底层琼脂 将1.4%琼脂凝胶加热融化后，倾注于 水平位置的平皿内，每皿6ml，凝固 后，用
4、前置55水浴锅中预温。 （三）表层琼脂的制备 将0.7%的琼脂融化后，置于55恒温 水浴箱中，依次加入以下试剂： 20%SRBC悬液0.1ml。 小牛血清0.1ml。 5.00106/ml脾细胞悬液0.1ml。 迅速混匀后，倾注于已铺好底层琼脂 的平皿内，使之均匀铺平凝固后，静 置约15min，放37温育2h。 （四）加补体 从温箱中取出平皿，每皿加入1:5稀 释的新鲜豚鼠血清1ml，继续放37 温箱中温育30min后取出，观察溶血 空斑。也可在室温下放置1h，4冰 箱过夜，次日观察结果。结果判定观察时，将平皿对着光亮 处，用肉眼或放大镜观察每个溶 血空斑的溶血状况，并记录整个 平皿中的空斑数
5、，同时求出每百 万个脾细胞内含空斑形成细胞的 平均数。 注意事项 对SRBC的要求：因为SRBC既是免疫原，也 是靶细胞和指示细胞，故要求SRBC应新鲜， 洗涤不超过3次，每次2 000r/min离心5min ，细胞变形或脆性增大者均不能使用。 2免疫所用SRBC的数量：尾静脉注射以 2.00104 个/0.2ml为宜。腹腔注射为 4.00108 个 /ml，用量小，如低于1.00107 个/ml注射0.5ml，空斑形成极少；用量过大 ，超过2.50109个/ml，不能形成空斑。 3采取免疫脾的时间：无论是经尾静脉还是 腹腔免疫，均以免疫后第四天取脾为宜， 过早或过晚空斑都形成极少。 4脾细胞
6、的活力： 为了保证脾细胞的活力 ，制备脾细胞过程中所用PBS（或Hanks 液），最好临用时方从4冰箱中取出，或 整个操作过程应在冰浴中进行。 5倾注平板的要求：底层要平，表层要把握 好温度。不要有气泡，表层基要求混合均 匀。6补体的活力：补体活力的大小，对 溶血空斑的形成关系很大。如出现抗 体或补体的活力低下，将不能形成空 斑。所以补体要新鲜，并宜将3只以 上豚鼠血清混合。试验中加入Ca2+、 Mg2+是为了活化补体。 7空斑计数：要求判读准确，避免辨 认造成的误差。遇可疑空斑时，应镜 检，对肉眼结果进行核对。 所以器皿和各种试剂在加入表层基前 均需预温。 SRBC可大致计数，但脾细胞计数必须 准确。 免疫动物必须用纯系动物，杂种动物 个体差异大，难以比较，最好先作几 次预实验，使每个玻片空斑数控制在 100-200个为宜。思考题 溶血空斑实验的意义？
