病毒感染实验诊断

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1、第四章病毒感染实验诊断 一般原则是特异敏感、快速和简 便。首先根据流行病学和临床特 点，初步判断可能感染的病毒。然后根据可疑病毒的生物学特点 、 机体免疫应答和临床过程，以及 病人当前所处的时机，确定实验 诊断方法。1.对潜伏期短，发病时尚无抗体产生，可选择测定病毒颗粒、病毒抗原或核酸。2.对潜伏期超过十天的感染，可检测特异性的IgM抗体来进行早期快速诊断，及区别初次和再次感染。3.对可在体内形成持续感染或潜伏感染的病毒，可检测急性期和恢复期双份血清的IgG抗体有无4倍以上升高，或直接检测病毒核酸 。4.对原因不明或有新病毒感染时，应采集标本进行病毒分离，同时应采取双份血清以确认分离的病毒为病

2、原体。5.对同一症状可有多种病毒引起的情况，应同时检测几种相关病毒的病毒颗粒、抗原或抗体， 6.对由多个型别组成的病毒可测定它们的共同抗原。 第一节标本采集与运送 一、标本的采集 1.采样时间 尽可能在发病的初期，急性期或患者人院的当天进行。 2.标本种类的选择 根据临床感染的症状及流行病学资料，判断可能感染病毒种类，选择相应部位采取标本。 常见分离病毒标本的选择 病毒咽拭子粪粪便 血液脑脑脊 液唾液 组织组织 柯萨萨奇A和B组组 +心 单纯单纯 疱疹病毒 +脑脑膜 腮腺炎病毒 +流感病毒 +轮轮状病毒 +HAV+HIV+ 精液3常见标本的采集方法 (1)血液：以无菌取抗凝血10ml。抗凝选用

3、100nml肝素钠。用于分离CMV、HSV，、黄病毒、EBV、HIV-1及新生儿肠道病毒。(2)脑脊液：以无菌取脑脊液12ml，冰浴立即送检。在4可存放72h。用于分离柯萨奇病毒、ECHO病毒、肠道病毒、腮腺炎病毒。(3)宫颈或阴道拭子：采取病灶部位分泌物，或将拭子伸人宫颈约lcm停留5秒取出，冰浴立即送检。用于分离 HSV、CMV。(4)粪便标本：取24粪便加10ml运送液立即送检，用于分离腺病毒、肠道病毒和轮状病毒。(5)含漱液：用无菌生理盐水让患者含漱。用于分离流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、RSV等。(6)喉拭子：用压舌板避免唾液污染，用拭子采取咽喉部表面。用于分离腺病毒、CMV、肠道病

4、毒、HSV、流感病毒等。(7)尿道拭子及尿液标本：尿道拭子伸人尿道4cm转动3次，以获得较多的上皮细胞，用于分离CMV和HSV。 (8)尸检标本：死亡后尽早采集各种器官，分别使用器械和容器。 二、标本的运送和保存病毒抵抗力弱，室温中容易灭活， 用于分离培养的标本要尽快送检， 4下数或-70。 冻存液中加入甘油或二甲基亚砜 (DMSO)等作保护。病毒传送培养基以Hanks液为基础加 灭活的小牛血清。为抑制细菌生长加 青霉素100Uml和链霉素100gml ， 为了抑制真菌的生长加入25gml 二性霉素B或40gml制霉菌素。 第二节 病毒分离与鉴定一、病毒的分离方法 1.组织细胞培养 根据细胞的

5、来源、特性和传代次数分为： (1)原代细胞培养：将细胞悬液。加入营养液培养。形成的单层细胞，称之为原代细胞。 (2)二倍体细胞株：仍保持二倍体特性。寿命一般为4050代，如人胚肺细胞。广泛用于病毒分离和疫苗制备。(3)传代细胞系：来于肿瘤细胞，染色体特征类似肿瘤细胞。常用的有人宫颈癌细胞(Hela)、人喉上皮癌细胞(Hep-2)。2鸡胚接种 鸡胚是用于分离粘病毒科、疱疹病毒、痘类病毒的较为理想的材料。 3动物接种 动物对病毒的敏感性是不同的，选择合适动物十分重要。小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等常用于分离病毒。 常用于病毒分离的细胞 细细胞种类类可分离的病毒 原代细细胞非洲绿绿猴肾细肾细 胞人单单

6、核细细胞人胚肾肾、肺细细胞 恒河猴猕猕猴肾细肾细 胞HSV、RSV、VZV、腮腺炎病毒、风风疹病毒 HIV、HTLV、HHV-6 腮腺炎病毒、腺病毒 ECHO、脊髓灰质质炎病毒、柯萨萨奇A、B组组、RSV二倍体细细胞株人胚肺成纤维细纤维细 胞株WI-38、MRC5 CMV、VZV、鼻病毒 腮腺炎病毒、腺病毒传传代细细胞系 HelaHep-2Vero 柯萨萨奇A、B组组、RSV 腺病毒、RSV HSV、RSV、风风疹病毒 、轮轮状病毒、麻疹病毒三、病毒的鉴定 必须通过全面了解其特性才能 得到鉴定。 1.根据临床特点，流行病学资料，标本来源，大致了解病毒的一些特性，有助于确认病毒的种类。2.动物感

7、染范围及特点 病毒感染动物的范围、发病的潜伏期。 3.细胞培养特点。综合上述资料作出鉴定。病毒鉴定的方法1.细胞培养的结果观察病毒增殖后导致细胞发生:细胞病变效应(CPE)。细胞肿大，变圆堆积成葡萄状，细胞溶解出现空斑，细胞融合形成多核巨细胞，胞浆内或核内出现嗜酸性或嗜碱性包涵体等；不出现细胞病变现象。 细胞培养液pH的变化。 2.中和试验病毒与特异性抗体进行免疫反应， 使病毒失去感染性，在细胞培养 和活的机体内不出现病变的试验。 常用细胞培养进行中和试验。如 果特异性抗体能中和病毒，使之 失去感染性，不出现细胞病变效 应，则该病毒为特异性抗体的同 型病毒，用于病毒的分型诊断最具敏感和 准确性

8、。也可用于检查患者病后 或人工免疫后，机体血清中抗体 增加情况。3.空斑或蚀斑形成试验空斑是指在单层细胞中被病毒感染引起死亡的细胞区域，周围被活细胞包围。一般而言，一个空斑是由一个感染性病毒颗粒感染所引起的。不同的病毒引起的空斑形态和大小不同。可进行病毒颗粒的计数、纯化，结合中和试验可进行病毒的鉴定。4.干扰现象某些病毒间存在着干扰现象，如某些型别的鼻病毒能干扰以后进入的副流感病毒的增殖，从而阻抑后者的红细胞吸附作用。5.红细胞吸附及吸附抑制试验正粘病毒，副粘病毒感染的宿主 细胞，病毒增殖后产生细胞病变， 但在细胞表面含有病毒某些抗原 成分(血凝素)，能吸附鸡、豚鼠 或猴红细胞。可作为初步鉴定

9、。如果在培养瓶 中加入相应的血凝素抗血清后， 不出现红细胞吸附现象，是为红 细胞吸附抑制试验阳性，可作为 病毒鉴定的依据。4血凝试验及血凝抑制试验 某些病毒可与一定种类的哺乳动物或禽类的红细胞产生血凝现象。加入相应的血凝素抗体可抑制血凝现象的发生，是为血凝抑制试验。可作为病毒型别确定的依据。5病毒的大小及形态 可用电子显微镜观察病毒的大小及形态。6核酸类型鉴别及序列测定利用5溴-2-脱氧尿苷(BUDR)抑制DNA复制的特性，在细胞培养液中加入该物质，可抑制DNA病毒的复制和增殖，抑制细胞病变的出现，但对RNA病毒无抑制作用，以此判断病毒核酸类型。对病毒核酸特异序列或全序列的 碱基排列测定或 D

10、NA杂交、DNA- RNA杂交来鉴定病毒。7耐酸试验 肠道病毒对酸有耐受力，而鼻病毒在酸性环境下易被灭活。8乙醚敏感试验 病毒外围如有类脂包膜，则易被乙醚破坏，而失去感染性，不能感染细胞。可作为病毒是否具有类脂包膜的依据，也可用氯仿或去胆酸钠代替乙醚进行试验。9免疫荧光抗体染色 将感染细胞固定，用特异抗血清荧光标记染色，在荧光显微镜下，可见细胞内荧光，即可确定型别。 第三节病毒感染快速诊断通过测定病毒的特异标志成分，如 特殊形态、特异的抗原成分及病毒 的核酸，早期确认病毒的感染，是 病毒学诊断的重大发展。 一、形态学检查1光学显微镜 观察病毒感染细胞出现的包涵体。根据特点可作出辅助诊断。狂犬病

11、病毒在脑细胞出现嗜酸性的圆形或椭圆形包涵体，称为内基小体。巨细胞病毒在上皮细胞的细胞核内出现周围绕有一轮晕似“猫头鹰眼”样大型嗜酸性包涵体。2电子显微镜检查(1)电镜直接检查：早期病毒感染标本的病毒颗粒。如“秋季泻”患儿粪便中的轮状病毒、甲肝患者粪便中的HAV，疱疹病毒的疱疹液，HBV患者血清，均可观察到特征性病毒颗粒。(2)免疫电镜检查：在标本中加入抗体。使病毒聚集成块负染观察，更易发现病毒体，灵敏度可提高100倍。二、病毒抗原检测病毒抗原是病毒特异性的标志，通过免疫学技术检测标本中特异性抗原存在，可以早期诊断病毒感染。1免疫荧光技术 适合于型别少，细胞培养难以成功的病毒，如流感病毒、副流感

12、病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒等。肝活检组织中的肝炎病毒、神经组织中的单纯疱疹病毒、脑组织中的狂犬病毒或其他脱落细胞和活检组织中的病毒抗原检测。2酶免疫技术 有酶免疫组化和酶免疫吸附(ELlSA)试验法。测定标本中游离的抗原或抗体。如检测乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)，HIV感染病人的P24抗体等。3.其他技术 如固相放射免疫技术、发光免疫分析技术、胶体金标记的免疫层析技术等。三、早期抗体检测检测病毒感染机体后产生的早期 特异性抗体，如测定特异性IgM可以 快速明确诊断各种病毒引起的新生 儿先天性感染，测定HAV感染后抗 HAV的IgM抗体可以明确诊断HA等。四、病毒核酸检测只要有完

13、整的特异基因片段存在，就可进行诊断。1斑点杂交法 将待测的DNA或RNA直接点在杂交滤膜上 ，变性后，用标记的核酸探针进行杂交 。用32p或131I同位素标记的探针通过放射 白显影，可直接观察。现用地高辛、生 物素等非同位素物质标记，然后采用酶 反应或酶免疫技术进行检测，已被越来 越多的实验室广泛使用。2固相杂交技术 将核酸探针包被聚苯乙烯微孔板中，加人待测的核酸序列和标记的指示探针杂交液中进行杂交，洗涤后，用酶免疫技术进行检测。3.原位分子杂交技术 在细胞原位暴露DNA或RNA，加入标 记特异核酸探针进行杂交。通过显 色技术可显示特定杂交探针在细胞 内的位置和核酸的数量。4.Southern

14、印迹和Northern印迹法 Southern印迹法用于DNA的杂交。提取DNA,用内切酶切割后，进行琼脂糖电泳按分子量使DNA分开，将DNA移至硝酸纤维膜上，用标记探针进行杂交。可以检测病毒DNA特异序列。Northern印迹法用于RNA杂交分析。将琼脂糖电泳后的RNA移至DBM膜上，用标记探针进行杂交。用于检测RNA或mRNA。5聚合酶链反应(PCR) 选择病毒的特异保守片段作为靶基 因，进行引物设计和扩增可诊断病 毒性感染。选择病毒的易变区，结 合RFLP，测序等技术可以对病毒进 行分型和突变的研究。(1)DNA病毒：可直接进行PCR扩增其特异片段。 (2)RNA病毒：可通过RT-PCR

15、技术，将RNA逆转录为cDNA，再进行PCR扩增。(3)定量PCR技术：对扩增的产物进行原始标本定量，对病毒感染的诊断起到了量化的作用。同时，对研究病毒和机体之间的关系提供了参考。 有些病毒如轮状病毒的核酸具有典 型的分节段特点。可以从标本中直 接提取轮状病毒的核酸。通过聚丙 烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，观察其特 有的11个核酸节段的条带排列情况， 进行诊断。 6病毒核酸的直接检测五、病毒检验的结果评价通过实验手段，从标本中获得有关病毒感染的证据，从而确定病毒感染和临床疾病之间的因果关系，是病毒实验诊断的目标。通过分离和鉴定获得致病性病毒， 发现病毒感染的特异征象，如机 体内产生特异性抗体,急性期和恢 复期血清中相应的特异性抗体有4 倍以上的升高，细胞内包涵体的形 成等,就可得出病原学诊断。感染病毒的临床意义必须结合流 行病学资料、临床表现、病毒种 类及机体的病理变化作综合分析， 才能判定。