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1、第八章 微生物转化l1952年，Peterson和Murray首先发现少根霉及黑根霉 能使黄体酮转化成11-羟基黄体酮。l几乎在同时，发现银样链霉菌能将孕酮氧化成16- 羟基孕酮。l后来，又相继发现细菌、酵母菌、霉菌和放线菌的某 些种类都可以使甾体类化合物的一定部位发生有价值 的转化反应。l目前微生物转化技术在药物合成中的应用日益扩大， 已成为合成工艺中不可缺少的关键技术。一、微生物转化的发现和应用第一节 概述微生物转化的概念微生物转化，就是利用微生物的一种或几种酶的专一催化功能，对某个有机化合物的分子结 构的特定位置，实现一种或几种化学反应，使其 转化成结构相似的更有价值的新化合物。利用的是
2、完整细胞中的酶的活性。这些细胞 可以是活的细胞正在生长的或静态的（细胞分裂很少或根本没有）细胞，也能使用干细胞或 孢子。二、微生物转化反应的类型和实例1氧化反应工业上大规模生产葡萄糖酸主要采用微生物转化。将氨基氧化为硝基醛基醇还原2、还原反应3、水解反应酯的水解、苷的水解、硫醚开裂等。4、缩合反应5、其他反应l 微生物转化反应，可以用静止细胞进行， 也可以用发酵方式进行转化以及应用固定化细 胞进行生产等。l 它跟酶法转化和有机化学转化比较有以下特 点：三、微生物转化反应的特点在微生物转化的反应中一般无需高压、强热等比 较苛刻的条件，只需在常温和pH为7左右的环境下 进行反应即可； 原料除了普通
3、的培养基和底物外没有其他化学品 ，一般普遍认为公害比较少； 设备简单，反应条件比较温和，生产安全。 微生物转化反应是酶催化的反应。在最合适条件 下，一秒内酶能催化底物转化成产物的分子个数 数量级是102lO6。1、反应条件温和、公害少、设备简单且反应速度快2、可以减少反应步骤 将几步中间体合成的多种酶通过基因构建到同一工程菌中，使在发酵法转化时需要几步催化台成的中间体只要一步就可以转化成功。 如维生素c生物合成中基因重组葡萄糖酸氧化杆菌的代谢工程菌，将L-山梨醇脱氢酶基因和L-山梨酮脱氢酶基因，通过基因重组构建出一个工程菌株，发酵过程可以在同一次转化发酵中将D一山梨醇转化成一酮一L古洛糖酸。3
4、、对立体结构具有高度的专一选择性 微生物转化反应不仅对结构有化学选择性 ，还有区域选择性、面选择性和对映异构 选择性。 微生物转化反应其实也是一种酶反应，对 底物作用时，具有高度的立体结构选择性。4、回收率高、成本低l微生物转化反应是在细胞内进行，保持原来整体 酶系比较符合生物催化所需环境和条件。l微生物转化反应可以持续进行、反应量大、回收 率高并可以大规模工业化生产。从设备和原料方 面来说生产成本低于酶法和化学合成法第二节 甾体微生物转化甾体类药物甾体药物的来源l化学合成（早期）：成本高，收率低。l微生物转化：收率提高，省去多步化学反应。l天然提取可的松化学合成法：难以在11位导入氧原子。S
5、arret：用576kg脱氧酸，2年，30余步反应，得到938mg醋酸可的松1952年，Petterson和Murry黄体酮霉菌进行11羟化再经10步化学法可的松可的松价格：从1949年每克30美元，降到1967年美1元。甾体化合物的基本骨架环戊烷多氢菲核（甾烷）具有右图结构特 征的化合物称为 甾体化合物一、甾体微生物转化的类型和特点（一）反应类型微生物对甾体每个位置都可以进行转化， 其中比较重要的转化位置和反应如下： 羟化：C9、C11 , 、C15、 C 16 , 等 羟基转化为酮基： C3、C3等 脱氢：A环的C1,2和C4,5位之间 芳香化：主要在A环上 环氧化：C9,11和C14,1
6、5之间 酮基还原为羟基：C3、C17、C20位上 双键的氢化：A环C1,2和C4,5以及B环C5,6之间的双键还原 边链降解：始于C17位羟化，经氧化，生成C17酮化合物(二）微生物转化甾体的特点1、两阶段发酵第一阶段：微生物的生长阶段，尽可能多获得与 转化反应相关的酶。第二阶段：微生物转化阶段，创造适合不同酶反 应的最适条件。2、两相发酵由于甾体化合物均难溶于水，因此任何反应 均在两相（水相和固相）进行。 甾体溶于有机溶剂后投入时，浓度不宜太高 通过超声粉碎使甾体细微颗粒后直接投放，可以提高投料浓度 也可以采用表面活性剂或双水相转化法二、甾体微生物转化反应的主要类型l甾体上羟化对化学合成而言
7、是非常困难的，除了 C17位上通过化学方法能导入羟基外，其它位置很 难导入。l通过微生物羟化酶，能非常专一地选择某个碳位置 上的某空间位置上的氢取代，氧化成为原来空间构 型的羟基。 （一）羟化反应1C9羟化C9羟化在甾体药物合成中是一个关键中 间步骤，涉及到甾体边链的选择性降解，并且 是皮质激素合成中一个关键中间体。由于C9位 上导入羟基后，容易在C9C10之间引入双键， 然后进一步形成C11羟基或导入氟原子。4-雄甾烯-3，17-双 酮9 -羟基-4-雄甾烯-3，17-双 酮甾体合成中重要中间体9-羟基-4-雄甾烯-3,17双酮 的生物转化2. C11羟化C11羟化是微生物特有的反应。微生
8、物转化实现甾体C11羟化，促进了皮质激 素类化合物的合成，为通过微生物转化来 寻找更有效新药开创了新途径。 新月弯孢霉能将Reichstein S化合物（简称化合物S ，Compound S）一步转化成氢化可的松。化合物S氢化可的松（二）环氧化反应l用微生物转化法在甾体母核上引入环氧基团的 反应与微生物羟基化有关。l能产生C11羟基化的新月弯孢霉或布氏小克汉 银汉菌都可将17，21-二羟基-4，9（11）- 孕甾二烯-3，20-二酮转化成9，11环氧化 合物。 （三）脱氢反应l当抗炎甾体激素等药物的母核C1，C2位置导入双 键后，其抗炎作用会成倍增加。l醋酸可的松C1，C2位上导入双键成醋酸脱
9、氢可的 松后抗炎作用增强34倍。R1 = 9F或H；R2 = H，6CH3，6F；R3 = H，16CH3，16OH， 16OH l化学法脱C1，C2氢是采用二氧化硒法，由于硒 在生产中难以除尽会使产品中带有少量对人体 有害的物质l采用微生物转化脱氢是甾体抗炎激素药物合成 中不可缺少的一步l微生物对甾体羟化与脱氢能力是相反的，细菌 的脱氢能力比真菌大，特别是棒状杆菌和分枝 杆菌活力最大。 （四）甾核及边链的选择性降解l具有生理活性甾体类药物的基本母核目前都是 从高等动植物中获得。l首先必须有选择性地对其边链进行降解,而不对 母核（环戊烷多氢菲核）进行降解。l化学法选择性差，产率低。目前，多采用
10、微生 物转化法。甾体药物的天然资源薯蓣皂苷元（约占60% ） 豆甾醇（约占15%） 胆甾醇 -谷甾醇前两种资源日渐耗尽，后两种资源来源 丰富，可以来自毛纺工业和油脂工业的废水 和下脚料。微生物可以将甾醇类化合物作为碳源利用 ，使边链和母核完全氧化为CO2和水。 工业上通过生物技术，可以控制微生物选 择性地降解上述来源的甾体边链，以获得重要 的甾体药物中间体： 雄甾-4-烯-3,17-双酮，简称4AD； 1,4-二烯-雄甾-3,17双酮，简称ADD； 3-氧联降胆甾-1,4-二烯-22-酸，简称BDA等 。生物技术控制途径 通过甾醇结构的修饰在甾体的A环形成芳香核后，不再发生母 核的破裂。引入C
11、6-19氧桥，阻碍C1,2双键的导入，从 而保护母核不被进一步降解。 在微生物降解过程中加酶抑制剂9羟化酶和C1,2脱氢酶是控制母核降解 的关键酶，抑制其活性即可抑制微生物降解 母核。如9羟化酶是一个含铁离子的单氧化酶， 可以选用能除去铁离子的络合物，或采用性质 相似又能取代铁离子的无活性试剂来抑制9羟 化酶活性，从而抑制母核降解。 通过诱变技术或利用基因工程技术改造菌种，造成相关酶的缺损，使得微生物只能选择性降解边链，而不降解母核。其他类型化合物的微生物转化1、甙类物质的生物转化 2、萜类分子的生物转化指在了解微生物生物合成途径以及克隆有关生物合成、调节等基因的基础上，在体外对这些不同来源（种内或种外）的基因进行删除、添加、取代以及重组，然后导入到一个适当的微生物宿主中并定向合成所需的一 系列化合物（“非天然”的天然化合物库）。 组合生物合成 （Combinatorial Biosynthesis） 构建组合化合物库的主要手段1、对生物合成基因簇实施突变2、异源表达生物合成基因簇3、重组结构域或模块组合生物合成的潜能：R=可利用的基因数；n=基因的等位形式可合成的化合物数 =RnR=4，n=4 Compounds=44=256组合生物合成面临的挑战1、对基因簇中每一个基因的功能不完全确定2、对生物合成的调控步骤不确定3、改变基因簇的组成可能影响酶的活性
