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1、质粒DNA的提取和鉴定 实验二十四目的 掌握碱裂解法提取质粒的方法 了解质粒酶切鉴定原理质粒DNA的提取方法 方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层 析法，质粒DNA释放法；酸酚法等。概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需) 选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求碱裂解法基本原理：1. 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒D
2、NA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来2.在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分 子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分 子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比 关系。因此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子 质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但 构型不同的DNA分子：其中超螺旋结构泳动最快 ，其次为线性结构，最慢的可能是复制中间体（ 没有复制完的两个质粒连在一起），而不是开环 结构（用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电 泳，就会看到线性质粒DNA的位置与
3、这三条带的 位置不一样）3. 溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光 一 细菌培养与质粒扩增1. 挑单克隆E.coli菌株接种到斜面培养基上（ 活化菌种），37过夜培养2. 从斜面培养基上挑E.coli菌株，接种于25毫 升液体培养液内（含氨苄青霉素），37振荡 过夜培养3. 从中取4毫升种子菌液于含M9培养基中（含Ap ），37振荡培养3-4小时（OD6001.0） 二 质粒提取 取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中， 12000r/min，4，30sec 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥
4、将细菌沉淀悬浮于100l预冷的溶液I中 ，剧烈振荡 加200L溶液II（新鲜配制），盖紧 Eppendorf管，快速颠倒5次，混匀内容物 ，将Eppendorf管放在冰上5.加入150L溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠 倒数次使混匀，冰上放置5min 6.12000r/min，离心5min，将上清夜转至另一 Eppendorf管中 7.向上清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置5- 10min。12000r/min离心5min。倒去上清夜，把 Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体 8.用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心， 倒去上清夜，真空抽干或空气中干燥 9.50L
5、 TE缓冲液，使DNA完全溶解（-20保存）酶切鉴定10L溶液 + 10内切酶缓冲液2L + 510U酶到一Eppendorf管 37 ，1-2h 加2L的反应中止液。 电泳：1. 1Agrose gel的制备 2. 上样3. 电泳 4. 紫外灯下观察和拍照 思考题染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么 ？参考答案纯化DNA的方法主要依据染色体DNA比质粒DNA分子大得多，而且染色体DNA被断裂成线状分子，但质粒DNA为共价闭环结构，当加热或用酸、碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却和回到中性pH时即恢复其天然构象注意 EB是诱变剂，配制和使用EB染色液时，应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的器皿或物品，必须进行清洗或弃去
