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1、生物工艺原理实验指导西北民族大学生命科学与工程学院生物工程下游技术实验指导1 实验一固定化酵母细胞发酵啤酒实验【实验目的】1. 了解固定化细胞技术的原理、方法和意义；2. 掌握酵母细胞的固定化技术；3. 掌握用固定化酵母细胞发酵啤酒的方法。【实验原理】固定化技术：固定化酶和固定微生物细胞的原理是将酶或微生物细胞利用物理的或化学的方法，使酶或细胞与水不溶性支持物（或称载体）相结合，保持酶和微生物的活性。由于酶和微生物细胞被固定在载体上，使得它们在反应结束后，可反复使用，也可贮存较长时间使酶和微生物活性不变。该项技术是近代工业微生物学上的重要革新，展示着广阔的前景。完整细胞的固定化对于细胞内酶的利
2、用有明显的优点，它保持了酶在细胞内环境中的稳定性，成本低，可以利用细胞内的复合酶系进行反应。包埋法是将微生物细胞均匀地包埋在水不溶性载体的紧密结构中，细胞不至漏出。由于在制备固定化细胞时，细胞和载体不起任何结合反应，细胞处于最佳生理状态，因此，酶的稳定性高，活力耐久。由于固定化酵母细胞有凝胶作为屏障，可避免外界不利因素的影响，因此能迅速增殖，结果单位体积内的酵母数比通常液体培养的高，同时增殖酵母凝集在凝胶表面形成浓厚的菌体层，因此酵母能迅速与基质接触，所以能缩短周期，提高啤酒的产量。固定化技术生产啤酒可使固定化细胞重复使用；发酵后菌体与发酵液易于分离；后处理工艺简单, 成本低；可连续发酵 ,
3、过程自动化。而传统发酵法酵母细胞发酵一次即弃去。【试剂和器材】1. 试剂菌种：安琪酵母。发酵培养基： 100ml 麦芽汁（或 20% 葡萄糖） ，蛋白胨 5g，配制 100ml，盛在 300mL三角瓶中，灭菌备用。固定化细胞材料（要求无菌） ：（1）5% 海藻酸钠溶液 5mL ，加热助溶，灭菌后，冷至45备用。（2）50mL 0.05mo1/L CaCl2，灭菌冷却后备用。（3）0.9%无菌生理盐水， 50mL 。2. 器材10ml注射针管、无菌玻璃棒、无菌封口膜封好的100mL三角瓶、300mL三角瓶、烧杯。生物工程下游技术实验指导2 【实验方法】1. 固定化酵母细胞前期准备酵母细胞的活化称
4、取 lg 干酵母，放入 50 mL 的小烧杯中，加人蒸馏水10 mL，用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀成糊状，放置1h 左右，使其活化。配制 0.05mo1/L 的 CaCl2溶液称取无水 CaCl2 0.83g。放人 200mL的烧杯中，加入150mL的蒸馏水，使其充分溶解，灭菌冷却后待用。配制 5% 海藻酸钠溶液称取 0.5g 海藻酸钠，放入50mL小烧杯中 . 加人 10mL蒸馏水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，灭菌后，冷至 45备用。2. 酵母细胞固定化在海藻酸钠溶液中 ,加入 2mL预热至 35的酵母细胞活化液 , 混合均匀 ,以无菌滴管缓慢而稳定的加
5、入CaCl2溶液, 边滴加边搅拌 , 即可得到直径约3mm 左右的凝胶珠，在CaCl2溶液中钙化 30min，即可使用。3. 固定化酵母细胞发酵啤酒在无菌玻璃棒帮助下倒掉CaCl2，将固定好的酵母细胞 ( 凝胶珠 )用生理盐水冲洗 2-3 次。将 20mL发酵培养基加入50mL锥形瓶中，并加入青霉素，再加入固定好的酵母细胞，置于28下发酵 24-48h。检测你酿制的啤酒风味和品尝啤酒 （若发酸或有其他异味， No drinking)。用刀片切开固定化酵母细胞颗粒观察。【注意事项】配制海藻酸钠溶液时注意加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。生物工程下游技术实验指导3 实验
6、二淀粉水解糖含量测定【实验目的】 1. 掌握工业生产中使用淀粉制葡萄糖的基本原理；2. 学习和掌握淀粉水解的工艺流程及其测定方法。【实验原理】淀粉是由数目众多的脱水葡萄糖单位(C6H10O5)n，经由糖苷键缩合而成的多糖。由淀粉质原料生产葡萄糖，很早以来人们就采用无机酸（通常为盐酸）作为催化剂，在高温高压条件下使淀粉发生水解反应，转变为葡萄糖。葡萄糖醛基在碱性溶液中可使高价铜还原成低价铜。当高价铜量固定时，被样品中葡萄糖还原后，剩下的高价铜可用标准葡萄糖溶液滴定借以 定量样品中的葡萄糖（实际为还原糖总和）。1. 水解: 淀粉包括淀粉、戊糖、半纤维素（主要指多聚戊糖），用盐酸加水分解转化成还原糖
7、。(C6H10O5)n+nH2O nC6H12O62. 中和：将余酸中和至pH 67，在碱性溶液中糖会分解，影响分析结果。 3. 当斐林氏甲、乙液混合时，生成Cu(OH)2沉淀。CuSO4+2NaOH NaSO4+Cu (OH)2Cu(OH)2再与酒石酸钠作用 COONa COONa HC-OH HC-O + Cu (OH)2 Cu +2H2O HC-OH HC-O COOK COOK 糖液滴入后铜盐被还原成红色氧化亚铜沉淀CHO COONa COOH COONa (CHOH)4 HCO (CHOH)4 HCOH +2 Cu +2H2O+ 2+ Cu2O CH2OH HCO CH2OH HCO
8、H COOK COOK HCl 生物工程下游技术实验指导4 Cu2O+K4Fe(CN)6 + H2O K2Cu2Fe(CN)6 + 2KOH CHO N020406080100第一季度第三季度东部西部北部(CHOH) 4 + + H2O(CH3) 2N S N+(CH 3) 2 Cl-CH2OH 氧化型（蓝色）CHO N020406080100第一季度第三季度东部西部北部(CHOH)4 + + HCl(CH3) 2N S N+(CH 3) 2-CH2OH 还原型（无色）斐林氏溶液全部被还原后，滴入的糖液便与次甲基兰指示剂作用，将其还原成无色化合物而达终点，为了加速反应，在斐林氏溶液中加入黄血盐
9、，使反应生成氧化铜红色沉淀变成可溶解状态，加速反应，并使终点由原来的蓝色转红色变为淡黄色，便于辨认。此法受操作条件影响很大，如温度高低、沸腾时间长短、pH 高低等。为了得到较准确的结果，必须保持操作尽量相对统一。另外，为避免酒石酸钾钠在强碱溶液中还原铜，影响结果，甲乙液必须现用现混。【试剂和器材】1. 斐林氏 A液：Cu SO45H2O 35g，次甲基兰 0.05g 溶解后定容至 1000mL。2.斐林氏 B液：酒石酸钾钠 117g, NaOH126.4g，亚铁氰化钾 9.4g，各自溶 解后定容至 1000mL。3.0.1%标准葡萄糖溶液：于100105烘干恒重而无水的葡萄糖称取1000mg加
10、水溶解，并加 5mL 浓 HCl 防腐，定容至 1000mL。此溶液使用期间如发现浑浊应重新配制。【实验方法】1. 称取 1.000g样品（湿淀粉 1.500g）置于 250mL 三角瓶中加 100mL 水，20%HCl 10Ml ，瓶口装一长玻璃管作为回流冷凝用，在水浴上加热3h 取 出放冷，滴酚酞指示剂，用1mol/L NaOH 中和至淡红色，移入250mL容量瓶中定容。2. 预备滴定：各取甲、乙斐林氏溶液4mL 于三角瓶中混匀加热至沸腾，滴 加 0.1%标准葡萄糖溶液至蓝色消失，记下体积数。生物工程下游技术实验指导5 3. 空白滴定：各取甲、乙斐林氏溶液4mL 于三角瓶中混匀，加入比预备
11、滴 定少 1mL 的标准葡萄糖溶液，加热沸腾后，继续用标准葡萄糖溶液滴定至终点。4. 样品滴定：各取甲、乙斐林氏溶液4mL 于三角瓶中混匀，加入5mL 转 化后的样品溶液，用空白滴定的方法滴至终点。5. 计算方法淀粉（ %）= （V1-V2 ） 0.10.9 = （V1-V2 ）4.5 W W 5 250 式中： V1空白滴定耗去标准葡萄糖溶液的mL 数V2样品滴定耗去标准葡萄糖溶液的mL 数W样品重量0.9葡萄糖折成淀粉的换算系数 【思考题】（1）缩小测定误差的关键是什么？（2）除了利用酸水解葡萄糖外，还有哪些水解葡萄糖的方法？生物工程下游技术实验指导6 实验三三叶草愈伤组织诱导及培养【实验
12、目的】学习并掌握外植体诱导愈伤组织培养方法。【实验原理】植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的重要因素，对有些植物材料而言，生长素和细胞分裂素对保持愈伤组织的快速生长是必要的，特别是两者结合使用时，能更强烈的刺激愈伤组织的形成。愈伤组织在离体培养过程中，组织和细胞的潜在发育能力可以在某种程度上得到表达，伴随着反复的细胞分裂，又开始新的分化。将脱分化的细胞团或组织重新分化而产生出新的具有特定结构和功能的组织或器官的一种现象，称为再分化。在一定的培养条件下，愈伤组织通过分化可以形成苗或根的分生组织甚至是胚状体，继而发育成完整的植株。【试剂和器材】1. 试剂NH4NO3、KNO3、CaCl2 2H2O、
13、MgSO4 7H2O、KH2PO4、MnSO4 4H2O、ZnSO4 7H2O、H3BO3、KI 、Na2MoO4 2H2O、CuSO4 5H2O、CoCl2 6H2O、Na2-EDTA 、 FeSO4 7H2O、 甘氨酸、肌醇、 盐酸硫胺素 (VB1)、 盐酸吡哆醇 (VB6)、烟酸、细胞分裂素（ BA ） 、生长素（NAA ） 、蔗糖、琼脂、 0.1%氯化汞、酒精、次氯酸钠、无菌水、三叶草新鲜叶片。2. 器材超净工作台、镊子、解剖刀、酒精灯、棉球、烧杯、容量瓶、细口瓶、广口瓶、培养皿、天平、移液管、高压蒸汽灭菌锅、电热烘箱。【实验方法】（一）培养基的配制1. MS 培养基的配制 （1）大量
14、元素母液的配制各成分按照表 1 培养基浓度含量扩大10 倍，用感量为 0.01g 的扭力天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到1000ml的容量瓶中，即为10 倍的大量元素母液。倒入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时，每配1L 培养基取此液 100ml。表 1 MS 培养基大量元素母液制备序号药品名称培养基浓度（ mg/L ）扩大 10 称量 (mg) 1 NH4NO31650 16500 蒸 馏 水 定容至 1000ml 2 KNO31900 19000 生物工程下游技术实验指导7 3 CaCl2 2H2O 440 4400 4 MgSO4 7H2O 370 3
15、700 5 KH2PO4170 1700 注意： 配制大量元素母液时，某些无机成分如Ca2+、SO 42一、Mg2十和 H 2PO4一等在一起可能发生化学反应，产生沉淀物。为避免此现象发生，母液配制时要用纯度高的重蒸馏水溶解，药品采用等级较高的分析纯，各种化学药 品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。特别应将 Ca2+、SO42一、Mg 2十和 H 2PO4一等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。 CaCl2 2H2O 要在最后单独加入，在溶解CaCl2 2H2O 时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的CO2，以防沉淀。另外， CaCl2 2H2O 放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。 （2）微量元素母液的配制MS 培养基的微量元素无机盐由7 种化合物（除 Fe ）组成。
